SN∕T 3437-2012 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3437-2012 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of potato spindle tuber viroid 2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和同发布国家质量监督检验检疫总局N-ON|h的寸的同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法SN/T川:-;7-2012中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(1000/15) 总编室:(010)61275323争斗网址中国标准出版社秦皇岛印
2、刷厂印刷争夺印张1.25 字数30千字2013年7月第一次印刷1/16 2013年7月第一版印数1-1600开本民ilOX 1230 7巳定价21.00 关书号155066 2-25287 SN/T 3437-2012 SN/T 3437-2012 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草o本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所O本标准主要起草人:刘洪义、刘忠梅、陈红运、吕典秋、邱彩玲、张洪洋、王振华、杨立群、
3、刘尚武。SN/T 3437-2012 马铃薯纺锤块茎类病毒检疫鉴定方法1 范围本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒Cpotato spindle tuber viroid)的检疫鉴定方法。本标准适用J二检测可能带有马怜薯纺锤块苇类耐毒的马铃薯脱毒苗、试管苗、不11苦、商品草、大田rjl生长的马铃薯及收获后的块茎、番茄、跨梨、人参果等其他寄主。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的寻|用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法S)J/T 2122 进出境柏物及材
4、物产品检疫抽样3 原理3. 1 马铃薯纺锤块茎类病毒基本信息种名:potato spindle tuber viroid 缩写:PSTVd异名:potato spindle tuber virus, potato gothic virus, tomato bunchy top viru日。分类:马铃薯纺锤块茎类病毒科Cfamilypo叩iviroidae),马铃薯纺锤块茎类病毒属(GenusPO叩lVlroid) 0 马铃薯纺锤块茎类病毒的其他信息参见附录Ao3.2 检疫鉴定依据PSTVd的基因到l特征和在奇主植物上的抗状特征是检疫鉴边的依据oPSTVd是一种具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配
5、对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子。PSTVd的RNA变性后转变为ft二环状分子,这种环状的RNA分子在聚丙烯酷肢凝胶电泳巾迁移率比相同相对分子质LA:的线状分子要慢得多。依据基因组特征建立往返聚丙烯眈胶凝胶电泳CReturn-Polyacrylamide Gel Elcctrophorcsis, R-PAGE)、RT-PCR、实时荧光RT-PCRCRcal-timcPCR)检测方法,这些方法结合寄主植物症状的有无和症状特征(参见附录A),判断样品是否带有PSTVdo4 仪器设备、用具及试剂4. 1 仪器设备PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离
6、心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、冷藏冷冻冰箱、电子天平、j品旋振荡器、烘箱等OSN/T 3437-2012 4.2 用具可调移液器(0.1L2. 5 p.L.2L20L.IO p.LlOOL,20 p.L200 p.L.IOOLl 000L) 和可调移液器头、离心管、研钵、微型磨样O4.3 试剂主要试剂见附录B、附录C、附录Do5 检疫鉴定5. 1 检测方法的选择及检测鉴定的流程本标准采用RT-PCR、实时荧光RT-PCR(Real-time PCR)、往返聚丙烯酷胶凝胶电泳(Return Polyacrylamide Gel Electrophoresis, R-PAGE)检测方法O检测
7、流和见图1、图20初级检测(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR) 有症状初级检测(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR) 无有症状症有症状状无症状有症状无症状三级检测试验方法(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR) 图1进口马铃薯种薯、商品喜、脱毒苗和试管苗系统检测确认PSTVd存在与否的判定方案2 SN/T 3437-2012 初级检测(R-PAGE、RT-PCR或Real-limePCR) 有症状有症状无症状无症状二级检测试验方法(R-PAGE、RT-PCR或Real-timePCR) 图2收获后的块茎或收获前大田植株系统检测确认PSTVd
8、存在与否的判定方案5_2 隔离种植及症状检查所有进境的脱毒苗、种苗等各类可繁殖的马铃薯材料都需要按有关要求隔离种植,生长温度应至少高于18O( (更适宜的温度是高于20OC)和至少16h的光周期。在生长期间进行严格的症状检查。仔细检查马铃薯植株是否有可疑症状,在花期或接近花期时,采集有可疑症状的植株叶片,进行室内检测,如果没有发现任何可疑症状,可随机取样。对于进境的手中薯可在隔离种植前对块茎进行症状检查,并取样,取样标准按照SN/T2122的规定执行。按流程故室内检测O对于产地检疫,可在花期或接近花期的生产田调查采样,也可采集收获后的薯块样品。症状检查可参见附录A。5.3 往返聚丙烯酷肢凝胶电
9、泳测定分别提取样品和对照的总RNA,进行往返聚丙烯眈胶凝胶电泳测定,健康的植物组织作阴性对照,感染PSTVd的植物组织作阳性对照,用DEPC水作空白对照。方法见附录Bo5.4 RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增。健康的柏物组织作阴性别照,感染PSTVd的植物组织作阳性对照,用DEPC水作空白对照O3 SN/T 3437-2012 具体操作见附录Co5.5 实时荧光RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA,进行实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照,感染PSTVd的植物组织作阳性对照,用DEPC水作空白对照C具体操作见附录D。6 结
10、果判定6. 1 脱毒苗与试管苗在隔离种植期间观察到可疑症状植株,经5.3、5.4、5.5中的任一种方法检测为阳性,则判断样品带有PSTVd;生长期间无症状植株样品.经单一方法检测结果为阳性,需不同方法再确认一次,两次结果都为阳性,则判断样品带有PSTVd。6.2 大田植株和收获后的尘k韦小需隔离币1植,检测结果判断力牛法相同O6.3 针对番茄、甥梨、人参果等其他寄主的结果判定,需对阳性RT-PCR产物进行序列测定,井和己知PSTVd株系的序列比对,序列和己知株系一致时,则判断样品带有PSTVd。7 样品保存7. 1 结果记录与资料保存完整的实验记录要包括:样品的来源、种类、时间、实验检测时间、
11、地点、方法和结果,井有实验人员的签字;往返聚丙烯眈肢凝胶电泳银染色结果图片、RT-PCR检测电泳结果图片、实时荧光RT-PCR检测结果图片。7.2 样品保存样品直接放于-800C冰箱或冷冻干燥后放于-800C冰箱保存1年甸保存的样品要做好标记和登记工作,以备豆验、谈判和仲裁oU存期f雨后,苗经火洁处型O4 SN/T 3437-2012 附录A(资料性附录)马铃薯纺锤块茎类病毒相关资料A.1 寄主范围自然寄主有马铃薯(50lI wn tuhero川In)、番茄CLy吵ersiciEsculentwn)、跨梨CPers1rlCa)、人参果(solummuricatum)、曼陀罗(Brugma川ia
12、sp)、素馨叶白英(Solanwnjasm inoides)、蓝花茄(S.f川tnnetii)、果酱木(5tre户tsoln1esii )和灯笼果(Ph.ysaliseruVl) 0人工接种寄主比较广泛,能感染31属94种。鉴别寄主:常用的鉴别寄主有鲁特恪尔斯番茄(Lyco旷日conesculentum cv Rutgers)和莫若(5co户。liasznenszs)。A.2 地理分布北美洲:美国(堪萨斯、缅因、马里兰、密西根、纽约、威斯康星),加拿大(阿尔伯特、哥伦比亚、新布伦斯维克、安大略、爱德华岛、魁北克)。欧洲:捷克、法国、德国、匈牙利、荷兰、波兰、斯洛伐克、瑞士、土耳其、英国、苏格兰
13、、前苏联O南美洲:阿根廷、乌拉圭、巳西、甜、鲁、古巴。非洲:南非、尼日利亚。亚洲:阿富汗、印度、日本、中国(河北、黑龙江、江苏人大洋洲:澳大利亚,新南威尔士,维多利亚。A.3 传播途径PSTVd可以通过机械接触、汁液接种及被感染的农机具、农民的衣物进行传播O此外,采用块茎生产繁殖时,如果切取块茎的切刀被污染也可传播该类病毒O咀嚼式昆虫的传播己有报道,但还未定论。当PSTVd和马铃薯卷叶病毒(potatoleaf roll virus, PLRV)混合侵染时,PSTVd可通过期虫传播。实生种子也是传播该类病毒的主要途径O远距离传播主要通过国际间或地区间种薯贸易OA.4 基因组特征PSTVd是一种
14、具有侵染性、无外壳蛋白、高度碱基配对的棒状共价闭合环状单链小的RNA分子OPSTVd的RNA变性后转变为开环状分子,这种环状的RNA分子在聚丙烯眈胶凝胶电泳中迁移率比相同分子量的线状分子要慢得多oPSTVd通常含有359个核昔酸,偶尔有358或360个核昔酸。在一种野生的茄属和西红柿中发现含356个核昔酸的PSTVd,在人参果中有356和357个核昔酸的PSTVd,各分离物在同源性上差异很小OA.5 寄主症状PSTVd侵染马铃薯引起的症状表现与类病毒株系、栽培品种品系及环境条件有关,PSTVd可以引SN/T 3437-2012 起植株矮化,茎轩直立僵硬,叶片叶柄与主茎的夹角变小,呈半闭半合状和
15、扭曲,叶片叶柄常呈锐角形态向上竖起。有的全株失去润泽的绿色,有的从上方观察叶子是暗绿色和皱缩的;有的顶部叶片变小、卷曲、耸立,有的感病植株不表现症状(见图A.l)。块茎变小,畸形,有的顶端变尖,圆形的块茎变长,有的表面开裂,有的芽眼突出,典型的块茎症状为纺锤形或哑铃形(见图A.2、图A.3、图A.4) 0 注:感病植株症状表现为束顶,叶片失绿变黄,植株僵硬C图A.1感染PSTVd马铃薯植株症状(中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局提供)注:从左向右三个块茎是感染PSTVd的症状,表现为纺锤形;最右边的一个块茎是健康对照。图A.2感染PSTVd的马铃薯块茎(引自EPPOStandards PM
16、7/33. potato spindle tuber pospiviroid) 6 SN/T 3437-2012 注:感病的块茎症状表现为纺锤形、畸形、龟裂。图.3感染PSTVd的马铃薯块茎(引自EPPOStandards PM 7/33. potato spindle tuber pospiviroid) 注:左边为感染PSTVd的块茎,表现症状为龟裂、纺锤形、畸形.右边为健康块茎。图.4感染PSTVd的马铃薯块茎(黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供)7 SN/T 3437-2012 附录B(规范性附录)往返聚丙烯酷肢凝胶电泳法B.1 试剂与材料以下所用试剂,除特别注明者外均为分析纯试
17、剂,水为符合GB/T6682中规定的一级水。B. 1. 1 0.5 mol/L Z.二肢四乙酸二铀溶液CpH8.0)称取乙二肢四乙酸二铀186.1 g,溶于700mL水中,用氢氧化纳调pH至8.0,加水定容至1 000 mLo B. 1.2 水饱和酣CpH4.0)B. 1.3 焦碳酸二乙醋CDEPC)处理的水在100mL水中,加入DEPC50L,室温过夜,121oC高压灭菌20min,分装到1.5 mL DEPC处理过的微量管中。B. 1. 4 3 mol/L Z.酸制溶液CpH5.2)称取三水合乙酸饷24.6 g,加水80mL溶解,用冰乙酸调pH至5.2,定容至100mLo B. 1. 5
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