超高效液相色谱—大气压化学电离—飞行时间质谱法测定油茶籽油中的3种甾醇.pdf
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1、基金项目:广州市市场监督管理局科技项目(编号:k j )作者简介:潘锦华,男,广州检验检测认证集团有限公司助理工程师,学士.通信作者:潘锦华(),男,广州检验检测认证集团有限公司助理工程师,学士.E m a i l:q q c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()超高效液相色谱大气压化学电离飞行时间质谱法测定油茶籽油中的种甾醇D e t e r m i n a t i o no f t h r e es t e r o l s i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l b ya t m o s p h e
2、r i cp r e s s u r ec h e m i c a l i o n i z a t i o nu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y潘锦华,P ANJ i n h u a,陈峰,CHENF e n g,白建平,B A IJ i a n p i n g,段雪菲,DU AN X u e f e i,李绮淇,L IQ i q i,(广州检验检测认证集团有限公司,广东 广州 ;国家加工
3、食品质量检验中心 广东,广东 广州 )(G u a n g z h o uI n s p e c t i o na n dT e s t i n gC e r t i f i c a t i o nG r o u pC o,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g ,C h i n a;N a t i o n a lQ u a l i t yT e s t i n gC e n t e r f o rP r o c e s s e dF o o dG u a n g d o n g,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g ,C h
4、i n a)摘要:目的:为准确测定油茶籽油中的谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇含量.方法:建立超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱测定方法.样品以 酮胆甾烷醇为内标物,m L乙醇加热回流提取 m i n,离心分层后,样液经X b r i d g eB EHC(mmmm,m)色谱柱洗脱分离,大气压化学电离源(A P C I)电离和正离子模式分析测试.结果:种甾醇在 m g/L的质量浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数R均大于 ,本底值,倍添加水平的回收率为 ,相 对 标 准 偏 差(R S D s)为 ,方 法 检 出 限 均 为 m g/k g,方 法 定 量 限 为m g/k g.结论:该方法操作
5、简单、溶剂消耗少且环保、回收率及重现性好,可用于准确测定油茶籽油中的种甾醇.关键词:超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱;大气压化学电离;油茶籽油;谷甾醇;菜籽甾醇;菜油甾醇A b s t r a c t:O b j e c t i v e:I n t h i ss t u d y,u l t r a p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h i g hr e s o l u t i o nq u a d r u p o l et i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m
6、e t e r(U P L C Q T O F/M S)w a se s t a b l i s h e dt od e t e r m i n e s i t o s t e r o l,b r a s s i c a s t e r o l,a n dc a m p e s t e r o l i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e d o i l M e t h o d s:U s i n g k e t o c h o l e s t a n o l a s t h e i n t e r n a ls t a n d a r da n d p e
7、 r f o r m i n gs a m p l ee x t r a c t i o n b y h e a t i n gi tf o r m i na n dr e f l u x i n g i tw i t h m Le t h a n o l A f t e rc e n t r i f u g a t i o na n d l a y e r i n g,t h r e es t e r o l sw e r es e p a r a t e db yX b r i d g eB EH C(mm mm,m)C h r o m a t o g r a p h i c c o l
8、u m ne l u t i o n F i n a l l y,i o n i z e d b y a t m o s p h e r i c p r e s s u r e c h e m i c a li o n i z a t i o ns o u r c ea n da n a l y z e db yp o s i t i v ei o nm o d e R e s u l t s:T h ei n t e r n a ls t a n d a r dc u r v e so f t h et h r e es t e r o l ss h o w e da no b s e r
9、v a b l e l i n e a rr e l a t i o n s h i pi n t h er a n g e o f m g/L,w h i l et h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tRw a sb o t hg r e a t e rt h a n T h ea v e r a g e r e c o v e r i e s a t,a n d t i m e s o f b a c k g r o u n dv a l u ew e r e i nt h er a n g eo f T h e r e l a t i
10、 v es t a n d a r dd e v i a t i o n(R S D s)w a sr a n g e df r o m t o M o r e o v e r,t h el i m i t s o f d e t e c t i o n w e r e m g/k g a n d t h el i m i t s o fq u a n t i t a t i o n w e r e m g/k g,r e s p e c t i v e l y C o n c l u s i o n:T h em e t h o dw a s s i m p l e i no p e r a
11、 t i o n,l o wi ns o l v e n t c o n s u m p t i o n,a n dt o x i c i t y I th a dg o o dr e c o v e r i e sa n dr e p r o d u c i b i l i t yt h a tc o u l db ea p p l i e df o r t h ea c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no f t h r e es t e r o l s i nc a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l K
12、e y w o r d s:U P L C Q T O F M S;A P C I;c a m e l l i ao l e i f e r as e e do i l;s i t o s t e r o l;b r a s s i c a s t e r o l;c a m p e s t e r o l油茶是一类山茶科山茶属的常绿小乔木或灌木.油茶籽压榨后所得茶油成分与橄榄油相似,含有 的不饱和脂肪酸.油茶籽油中含有大量的多酚,甾醇等活性成分,具有极强的抗氧化作用,因此 有 降低 血脂、预防心脑血管疾病等作用.而油茶籽油中的甾醇,主要有谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇等,具体结构式见图.有研究表
13、明,谷甾醇可减轻幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠胃组织炎症,也具有降脂抗肿瘤等作用.由于油茶籽油中含有大量的甾醇,因此被作为健康食用油F OO D&MA CH I N E R Y第 卷第期 总第 期|年月|图种甾醇的化学结构F i g u r eC h e m i c a l s t r u c t u r eo f t h r e es t e r o l s而得到广泛的推广.目 前 对 于 植 物 油 中 的 甾 醇 测 定 方 法 主 要 集 中 在H P L C法、G C法 、H P L C M S/M S法 和G C M S及G C M S/M S法 ,其中,色谱法由于检测器选择性较低,谱图
14、容易受杂质影响,而且分离难度大,因此通常需要在前处理中对样品进行皂化,耗时耗力,且影响回收率.而质谱法中,气相色谱质谱法的报道相对较多,相比于与非质谱检测器联用,具有更高的选择性,也能在短时间内实现多种化合物测定.研究拟以加热回流为提取手段,无需对样品进行皂化,利用高分辨飞行时间质谱精确分子量进行测定,内标法定量,以期为建立植物油中甾醇类物质的测定及相关指纹图谱提供参考.材料与方法仪器与设备飞行 时 间 质 谱 仪:T r i p l e T O F 型,美 国A B s c i e x公司;超高效液相色谱仪:U P L C A D型,日本岛津公司;高速离心机:k 型,德国西格玛公司;多管漩涡
15、振荡器:M u l t iR e a x型,德国H e i d o l p h公司;数显恒温电热板:D B B型,常州润华电器有限公司.材料与试剂油茶籽油:市售;甲酸、乙腈、乙醇:色谱纯,美国赛默飞世尔公司;谷甾醇、菜 籽 甾 醇、菜 油 甾 醇、酮 胆 甾 烷 醇:纯度,上海安谱实验科技股份有限公司.标准溶液的配制标准储备液分别称取 m g种甾醇及内标,无水乙醇溶解并定容至 m L容量瓶,配制成 m g/L的标准储备溶液.内标工作液将 酮胆甾烷醇标准储备液,用无水乙醇稀释成质量浓度为m g/L的标准内标工作液.标准工作液取上述标准储备液加入内标液配制,m g/L的工作曲线,其中内标质量浓度为
16、m g/L.样品处理条件称取g油茶籽油样品于 m L圆底烧瓶中,加入 m L内标工作液,涡旋混匀,连同圆底烧瓶重新称重.控制 电 热 套 温 度,在 乙 醇 微 沸 条 件 下,加 热 回 流 m i n,冷却至室温后,用无水乙醇补足失重,涡旋混匀,取m L溶液于离心管中,以 r/m i n离心 m i n,取上清液过 m有机滤膜,待测定.仪器条件色谱条件色谱柱:X b r i d g eB EH C(mmmm,m);色谱柱柱温:;进样量:L;流动相A为 乙 腈,B为 甲 酸 水 溶 液;流 动 相 流 速:m L/m i n;梯度洗脱程序:m i n,A;m i n,A;m i n,A;m
17、i n,A;m i n,A.质 谱 条 件离 子 源:大 气 压 化 学 电 离 源(A t m o s p h e r i cp r e s s u r ec h e m i c a l i o n i z a t i o n,A P C I);扫 描方式:正离子;离子源温度:;离子源电压:V.四极杆质量扫描范围:D a;去簇电压D P:V,碰撞能量C E:,e V;全信息串联质谱模式检测,灵敏 度 模 式;扫 描 时 间 间 隔:m s;校 正 液 流 速 为m L/m i n,每 个样品进行一次自动校正,以确保系统在批内的精准质量数稳定.回收率试验设计通过初步测定批量样品,选择种甾醇含量
18、较低的样品进行加标回收试验,对含量较高的化合物,按照其测得的本底值的,倍进行添加,含量相对较低的,按照本低值的,倍进行添加,在优化后的方法下进行次平行测定,计算相对标准偏差以评价试验重复性.方法的应用使用优化后的方法,对样品进行测定,每个样品平行测定次,记录相应平均回收率及相对标准偏差.数据分析及绘图待测定化合物信息由A n a l y s tT F软件采集,根据TO F M S和I D A M S高分辨质谱获得化合物的准确分子量,采用P e a k V i e w,M a s t e r V i e w 和M u l t i Q u a n t 等软件进行定性定量分析处理.结果与讨论提取条件
19、的优化提取溶剂体积的选择试验初期对提取溶剂体积|V o l ,N o 潘锦华等:超高效液相色谱大气压化学电离飞行时间质谱法测定油茶籽油中的种甾醇进行优化,由于油茶籽油均为阳性样品,且含量较大,因此难以使用本底值相当的浓度进行加标.为了考察对应的提取效率,试验选择含量较高的样品为对象,以不同提取溶剂体积对同一样品最终测得的含量为判定依据,对提取溶剂体积进行优化,结果如图所示.随着提取溶剂体积 的 增 大,种 甾 醇 测 得 的 含 量 均 在 增 加,在 m L时,基本提取充分,体积继续增大,测得的含量基本持平,最终选择 m L为提取溶剂体积.图提取溶剂体积对提取含量的影响F i g u r e
20、E f f e c t so f s o l v e n t v o l u m eo ne x t r a c t i o nc o n t e n t加热回流时间的选择试验对最佳的加热回流时间进行探讨,种甾醇的沸点均较高,因此具有一定的热稳定性,可长时间加热提取,但长时间加热不但检测成本增加,还会导致乙醇蒸发过多,随时间的推移,提取液中目标物浓度过大,乙醇和油两相之间平行系数发生变化,而导致提取率下降.试验使用 m L的提取液,分别对同一样品提取,m i n,结果发现,谷甾醇在提取 m i n时,提取含量基本达到最大,但菜籽甾醇和菜油甾醇在 m i n时的提取含量明显要比 m i n时的高
21、,因此,综合考虑,最终选择提取时间为 m i n,详细结果见图.质谱条件的确定根据种甾醇的化学结构分析可知,其结构中主要含有烃基,使用不同的离子源,不同的模式电离,可能会产生不同的母离子.试验分别对比了种甾醇在电喷雾电离源(E S I)和大气压化学电离源(A P C I)下的母离子响应强度.结果发现,种甾醇在E S I和A P C I源的负模式下,均没有响应,主要是因为种甾醇的羟基较稳定,没图提取时间对提取含量的影响F i g u r eE f f e c t so f e x t r a c t e dt i m eo ne x t r a c t i o nc o n t e n t能失去
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