柴胡疏肝散对功能性消化不良大鼠AMPK_SIRT3信号通路的影响.pdf
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1、 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.11,Nov.2023 上海中医药杂志柴胡疏肝散对功能性消化不良大鼠AMPK/SIRT3信号通路的影响王煜姣,王香香,杨珂鸣,叶丽亚 叶尔太,凌江红上海中医药大学附属曙光医院消化内科(上海 201203)【摘要】目的基于氧化应激及腺苷一磷酸(AMP)活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子3(SIRT3)信号通路探讨柴胡疏肝散干预功能性消化不良(FD)大鼠的作用机制。方法将32只SD大鼠随机分为正常组、模型组、柴胡疏肝散组、多潘立酮组,每组8只。模型组、柴胡疏肝散组、多潘立酮组均用
2、改良夹尾刺激法造模,造模的同时正常组和模型组予质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃,柴胡疏肝散组和多潘立酮组分别予柴胡疏肝散水煎液(4.8 g/kg)、多潘立酮混悬液(4.5 mg/kg)灌胃,连续干预4周。干预结束后,检测大鼠胃排空率,苏木精-伊红(HE)染色法观察胃组织病理变化,透射电镜观察胃Cajal间质细胞(ICCs)线粒体超微结构,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测大鼠胃组织AMPK、SIRT3、锰
3、超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA表达水平,Western blot法检测大鼠胃组织磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、SIRT3、MnSOD、微管相关蛋白轻链3(LC3)、P62蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠胃排空率降低(P0.05),ICCs线粒体肿胀、形态欠规则,分支较多,呈空泡化改变,见自噬小体;与模型组比较,柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠胃排空率升高(P0.05),ICCs线粒体结构损伤减轻。与正常组比较,模型组大鼠血清 ROS、MDA 水平升高(P0.05),SOD、CAT、GSH-Px 水平降低(P0.05);与模型组比较,柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠血清ROS、M
4、DA水平降低(P0.05),SOD、CAT、GSH-Px水平升高(P0.05)。与正常组比较,模型组大鼠胃组织AMPK、SIRT3、MnSOD mRNA表达水平降低(P0.05);与模型组比较,柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠胃组织AMPK、SIRT3、MnSOD mRNA表达水平升高(P0.05)。与正常组比较,模型组大鼠胃组织LC3蛋白表达水平升高(P0.05),SIRT3、MnSOD、P62蛋白表达水平及p-AMPK/AMPK值降低(P0.05);与模型组比较,柴胡疏肝散组、多潘立酮组大鼠胃组织LC3蛋白表达水平降低(P0.05),SIRT3、MnSOD、P62蛋白表达水平及p-AMPK/A
5、MPK值升高(P0.05)。结论柴胡疏肝散可有效促进FD大鼠胃动力,其作用与激活AMPK/SIRT3通路、减轻线粒体氧化应激、抑制ICCs自噬有关。【关键词】功能性消化不良;柴胡疏肝散;经典名方;中医药疗法;作用机制;氧化应激;自噬;大鼠Effects of Chaihu Shugan Powder on AMPK/SIRT3 signaling pathway in rats with functional dyspepsiaWANG Yujiao,WANG Xiangxiang,YANG Keming,YEERTAI Yeliya,LING JianghongGastroenterolog
6、y Department,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,ChinaAbstract:Objective To investigate the mechanism of Chaihu Shugan Powder in treating functional dyspepsia(FD)in rats through exploring oxidative stress and the AMP-activated protein k
7、inase/sirtuin 3(AMPK/SIRT3)signaling pathway.Methods Thirty-two SD rats were randomly divided into four groups:normal group,model group,Chaihu Shugan Powder group,and domperidone group,with eight rats in each group.The model group,Chaihu Shugan Powder group,and domperidone group were modeled using t
8、he modified tail-clamping stimulation method.The normal group and model group were administered 0.9%sodium chloride solution by gavage,while the Chaihu Shugan Powder group and domperidone group were administered Chaihu Shugan Powder aqueous decoction(4.8 g/kg)and domperidone suspension(4.5 mg/kg)by
9、gavage for four consecutive weeks.After the intervention,the gastric emptying rate of the rats was detected,hematoxylin-eosin(HE)staining was used to observe the histopathological changes in the DOI:10.16305/j.1007-1334.2023.2308049创 新 中 药 与 经 典 名 方 专 栏基金项目 国家自然科学基金项目(81973774,82174309)作者简介 王煜姣,女,博士
10、研究生,主要从事中医药防治脾胃病研究工作通信作者 凌江红,教授,博士研究生导师;E-mail:5上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.11,Nov.2023 gastric tissue,transmission electron microscopy was used to observe the mitochondrial ultrastructure of gastric interstitial cells(ICCs),and enzyme-linked immunosorbent assay(EL
11、ISA)was used to detect the levels of reactive oxygen species(ROS),malondialdehyde(MDA),catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD),and glutathione peroxidase(GSH-Px)in the rat serum.The mRNA expression levels of AMPK,SIRT3,and manganese superoxide dismutase(MnSOD)in the rat gastric tissue were quantifie
12、d using real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-qPCR).Additionally,Western blot assay was used to detect the protein expression levels of phosphorylated AMPK(p-AMPK),AMPK,SIRT3,MnSOD,microtubule-associated protein light chain 3(LC3),and P62 in the rat g
13、astric tissue.ResultsThe model group of rats exhibited a lower gastric emptying rate than the normal group(P0.05).Additionally,the mitochondria of ICCs in the model group displayed characteristics such as swelling,irregular morphology,increased branching,vacuolization,and the presence of autophagic
14、vesicles.The gastric emptying rate was higher in both the Chaihu Shugan Powder group and the domperidone group than that in the model group(P0.05),and there was a reduction in damage to the ICCs mitochondrial structure in both groups.Compared with the normal group,the model group showed elevated ser
15、um levels of ROS and MDA(P0.05)and decreased levels of SOD,CAT,and GSH-Px(P0.05).However,compared with the model group,the Chaihu Shugan Powder group and the domperidone group exhibited decreased serum levels of ROS and MDA(P0.05)and increased levels of SOD,CAT,and GSH-Px(P0.05).The mRNA expression
16、levels of AMPK,SIRT3,and MnSOD in the gastric tissues of rats were reduced in the model group compared with those levels in the normal group(P0.05).However,both the Chaihu Shugan Powder group and the domperidone group showed higher mRNA expression levels of AMPK,SIRT3,and MnSOD in the rat gastric ti
17、ssues than the model group(P0.05).The protein expression level of LC3 in the rat gastric tissues was higher in the model group than that in the normal group(P0.05).Furthermore,the protein expression levels of SIRT3,MnSOD,P62,and the ratio of p-AMPK/AMPK were lowered(P0.05).Conversely,the protein exp
18、ression level of LC3 in the rat gastric tissues was lower in both the Chaihu Shugan Powder group and the domperidone group than that in the model group(P0.05),and the protein expression levels of SIRT3,MnSOD,P62,and the ratio of p-AMPK/AMPK were increased in both the Chaihu Shugan Powder group and t
19、he domperidone group(P0.05).ConclusionChaihu Shugan Powder can effectively promote gastric motility in rats with FD by activating the AMPK/SIRT3 pathway,reducing mitochondrial oxidative stress,and inhibiting autophagy in ICCs.Keywords:functional dyspepsia;Chaihu Shugan Powder;classic Chinese prescri
20、ptions;traditional Chinese medicine therapy;mechanism of action;oxidative stress;autophagy;rat功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是临床常见的功能性胃肠病,症状持续、反复,严重影响患者的生活质量,我国FD的患病率为3.1%15.6%1-2。胃动力障碍是本病的主要发病机制之一,Cajal间质细胞(ICCs)决定着胃肠道平滑肌收缩的节律3-4。柴胡疏肝散出自 景岳全书,是疏肝理气的经典名方。课题组前期研究5发现,柴胡疏肝散可降低FD模型大鼠胃组织线粒体活性氧(ROS)含量,从而
21、减轻胃组织线粒体氧化应激,进而抑制ICCs线粒体自噬,促进胃动力。腺苷一磷酸(AMP)活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子3(SIRT3)是氧化应激相关通路之一。为进一步探讨柴胡疏肝散治疗FD的作用机制,我们观察了该方对FD模型大鼠氧化应激相关指标及AMPK/SIRT3信号通路的影响,以期为FD的临床诊疗提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1动物雄性SD大鼠32只,体质量180 g左右,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。动物生产许可证号:SCXK(沪)2017-0005。动物使用合格证号:20170005059985。所有大鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心,室温 2225,相对
22、湿度(5510)%,光照、黑暗时间各12 h交替。本实验方案经上海中医药大学实验动物伦理委员会审核批准(伦理批准号:PZSHUTCM210926008)。1.1.2药物与试剂多潘立酮片,西安杨森制药有限公司(批号:KDJ3YSP),研磨后用蒸馏水配制成浓度为0.45 g/L的混悬液。柴胡(批号:210526)、白芍(批号:210128)、川芎(批号:210206)、枳实(批号:210630)、陈皮(批号:210711)、香附(批号:210617)、炙甘草(批号:210417),均购自上海中医药大学附属曙光医院中药房。按原方药物配伍比例称取药物并加入没过中药23 cm的蒸馏水浸泡 30 min,
23、武火煮沸后转文火继续煎煮1520 min,留取药液;复煮1次,将两次药液合并后按照课题组前期确定的柴胡疏肝散的最佳给药剂量6,配制成生药浓度为0.48 g/mL的水煎液。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、ROS检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒,上海威奥生物有限公司(批号 分 别 为 C0105S、ER9407M、ER9405M、ER9406M、ER9404M、ER9402M、WB
24、0101、WB0130);SIRT3兔多克隆抗体,美国 Abcam 公司(批号:ab246522);AMPK 抗体、微管相关蛋白轻链3(LC3)抗体、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)抗体、泛素结合蛋白P62抗体,武汉三鹰生物技术有限公司(批号分别为 18167-1-ap、18725-1-ap、6上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.11,Nov.2023 24127-1-ap、18420-1-ap);辣根过氧化物酶(HRP)标记抗兔二抗、-肌动蛋白(-actin)抗体,上海威奥生物有限公司(批号分别为WB01
25、77、WB0196);氯仿、异丙醇、无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司(批号分别为20181221、T20090115、20210512);总RNA提取试剂盒,日本TaKaRa株式会社(批号:AI91731A)。1.1.3主要仪器组织匀浆器,北京鼎昊源公司(型号:TL-2010S);离心机,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:Fresco21);全波长酶标仪,美国Thermo Fisher Scientific 公司(型号:MutiskanTM GO);伯乐电泳仪,美国 Bio-Rad 公司(型号:BIO RAD POWER PAC 3000);荧光定量 PCR 仪
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