不同无血清培养体系对人脐带间充质干细胞生物学功能的影响.pdf
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1、864研究论著新医学 2023 年12 月第 54 卷第 12 期不同无血清培养体系对人脐带间充质干细胞生物学功能的影响林惠珠 李翠平 陈晓燕 阳莉【摘要】目的 探讨 3 种不同无血清培养体系对人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)体外培养的生物学功能的影响。方法 取 3 株脐带组织,各分 3 组实验组,经贴壁法分别置于 3 组不同无血清培养体系(A 组:纯化学成分合成的无血清培养体系,B 组:血小板裂解物+基础培养基的无血清培养体系,C 组:纤维蛋白原包被+含重组人蛋白质的无血清培养体系)中培养至第 3 代,比较其细胞增殖能力、细胞表型、三系分化能力以及免疫调节功能。结果 3组实验组细胞均呈长
2、而扁平的梭形,贴壁生长,大小均一。其增殖曲线趋势相似,A 组和 B 组 P2、P3 代次的增殖能力优于 C 组(P 均 0.05)。3 组实验组细胞均符合国际干细胞协会对 hUC-MSC 细胞表面标志物鉴定的要求,A 组和 B组 P3 代次的 CD29 和 CD90 的表达量均高于 C 组(P 均 0.05)。结论 3 种不同无血清培养体系的 hUC-MSC 均能保持其基本的生物学特性和免疫调节活性,纯化学成分合成的无血清培养体系和血小板裂解物+基础培养基的无血清培养体系的增殖能力和细胞表面标志物表达均优于纤维蛋白原包被+含重组人蛋白质的无血清培养体系。【关键词】人脐带间充质干细胞;无血清培养
3、体系;生物学功能 Effects of different serum-free culture systems on the biological function of hUC-MSCs Lin Huizhu,Li Cuiping,Chen Xiaoyan,Yang Li.Biotherapy Center,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,ChinaCorresponding author,Yang Li,E-mail:【Abstract】Objective To evalua
4、te the effects of three different serum-free culture systems on the biological function of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSC)cultured in vitro.Methods Three strains of umbilical cord tissues were obtained,divided into 3 experimental groups and cultured to the 3rd generation(P3)in t
5、hree different serum-free culture systems(Group A:serum-free culture system synthesized by pure chemical components,group B:serum-free culture system consisting of platelet lysate+basic culture medium,group C:serum-free culture system consisting of fibrinogen coating+recombinant human protein).The c
6、ell proliferation,cell phenotype,three-line differentiation and immunomodulatory function were compared.Results All the cells in three groups were long and flat fusiform,adherent to the wall and uniform in size.The proliferation curve trend was similar,and the proliferation ability of P2 and P3 gene
7、rations in groups A and B was better than that in group C(both P 0.05).The cells in three experimental groups all met the requirements of the International Stem Cell Society for identification of hUC-MSC cell surface markers.The expression levels of CD29 and CD90 in P3 generations in groups A and B
8、were higher than those in group C(all P 0.05).Conclusions The hUC-MSC in three groups can maintain basic biological characteristics and immunomodulatory activity.The proliferation ability and expression levels of cell surface markers in groups A and B are superior to those in group C.【Key words】Huma
9、n umbilical cord mesenchymal stem cell;Serum-free culture system;Biological function基金项目:广东省药品监督管理局科技创新项目(2021TDB22)作者单位:510630 广州,中山大学附属第三医院生物治疗中心通信作者,阳莉,E-mail:DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2023.12.0052023 年12 月第 54 卷第 12 期865新医学 人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,因来源广泛、取材方便、低免疫原性、增殖能力强等优点,
10、已被广泛应用于基因治疗等研究领域1-3。在临床、科研应用前,需要通过初步分离和体外扩增以获得足够数量的 hUC-MSC,而影响 hUC-MSC 培养效率和安全性的关键因素在于细胞培养体系。目前,在体外选用不同培养体系培养 hUC-MSC 方面,无血清培养体系的安全性和培养效率优于动物血清培养体系4-5。无血清培养更利于细胞的生长,容易进行纯化和下游加工、细胞功能的精准评估、增强生长和产量、增强细胞内中介物的检测,可以消除来自血清的不均一性,简化分离纯化步骤和鉴定各种细胞产物的程序,避免病毒污染造成的危害。经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基成为当今细胞培养领域的一大趋势。无血清培养基一
11、般包括细胞因子合成物和人血小板裂解物,不同的培养基成分对细胞的生长影响较大,因此本研究采用 3 种不同无血清培养体系对 hUC-MSC 进行体外扩增培养,比较培养后细胞的形态、增殖能力、表面标志物的表达率、三系分化能力及免疫调节作用的差异,以筛选出最佳的无血清培养体系,提高 hUC-MSC的细胞产量和质量。材料与方法一、材 料1.脐带组织3 株约 30 cm 的脐带取自中山大学附属第三医院岭南医院产科健康供体,且供体签署知情同意书。供体筛选标准:HBV、丙型肝炎病毒、HIV、巨细胞病毒、EB 病毒、梅毒检测均为阴性,且无家族遗传病史,无传染病史。本研究获中山大学附属第三医院干细胞临床研究机构伦
12、理专家委员会批准(批件号:2020 年份14 号)。2.试剂与仪器间充质干细胞无血清培养基、消化酶均购自友康生物科技(背景)股份有限公司。Helios UltraGROTM 购自美国 AventaCell 公司。MSC-T4 购自珠海贝索生物技术有限公司。-MEM 培养基、RPMI 1640 培养基、DMEM 低糖培养基均购自美国Gibco 公司。OriCell 人脐带间充质干细胞成脂、成骨、成软骨诱导分化培养基试剂盒均购自广州赛业生物科技有限公司。人淋巴细胞分离液购自挪威Axis-shield 公司。调节性 T 细胞(Treg)检测试剂盒、白细胞活化试剂盒、破膜剂和流式抗体 FITC-CD3
13、、APC-CD8、PE-cy7-IFN-、APC-IF-17A、FITC-CD8均购自美国 BD 公司。流式抗体 CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC 均购自美国 Bechman 公司。CD3 细胞分选磁珠购自德国 Miltenyi 公司。CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒购自美国 Thermo Scientific 公司。CD3、CD28单克隆抗体和 IL-2 购自美国 Perprotech 公司。倒置显微镜购自德国 Leica
14、DMil 公司,离心机购自德国Eppendorf 公司,二氧化碳培养箱购自美国 Thermo Scientific 公 司,流 式 细 胞 仪 购 自 美 国 Bechman Coulter 公司。二、方 法1.hUC-MSC 的分离培养将 3 株脐带组织分别设为 3 组实验组,A 组:纯化学成分合成的无血清培养体系,B 组:血小板裂解物+基础培养基的无血清培养体系,C 组:纤维蛋白原包被+含重组人蛋白质的无血清培养体系。分别剔除脐带表皮和血管,取华通氏胶,剪至 3 mm3大小平均接种于 9 个 150 mm 培养皿,每组 3 个 150 mm 培养皿,分别加入 3 种不同无血清培养基,置 3
15、7、5%二氧化碳培养箱中培养至细胞融合度达 20%30%,消化收集细胞记为 P0代细胞,分别继续传代培养至 P3 代,冻存备用。2.hUC-MSC 的增殖活性 分别将 P0 代次的 hUC-MSC 以 8 000 cells/cm2 的密度接种于培养瓶中,待细胞融合度为 80%90%,收集细胞、计数、传代至 P3 代,绘制细胞生长曲线。3.hUC-MSC 表面标志物的检测收集 P3 代次 hUC-MSC,用生理盐水洗涤后将细胞浓度调整为 2106 cells/mL,按每管 100 L 分别加入 5 L 的 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD1
16、66、人类白细胞抗原(HLA-DR)单克隆抗体,混匀、4 避光孵育 30 min;用生理盐水洗涤、重悬后,用流式细胞仪检测hUC-MSC 细胞表面标志物的表达情况。4.hUC-MSC 体外三系潜能诱导分化收集 P3 代的 hUC-MSC 按成骨诱导分化培养试剂盒培养 24 周,用 4%多聚甲醛固定细胞,行2023 年12 月第 54 卷第 12 期866新医学 茜素红染色,镜检观察。收集 P3 代的 hUC-MSC 按成脂诱导分化培养试剂盒培养 24 周,4%多聚甲醛固定细胞,行油红 O 染色,镜检观察。收集 P3 代的 hUC-MSC 按成软骨诱导分化培养试剂盒培养4周后,用4%多聚甲醛固定
17、细胞团。取人软骨组织为阳性对照、脐带组织为阴性对照,切片,行苏木素染色,镜检观察。5.hUC-MSC 免疫调节功能5.1 单个核细胞的提取通过密度梯度离心法分离 30 mL 健康人外周血提取单个核细胞,加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)重悬、用 CD3 磁珠分选提取细胞,分选后用 FITC-CD3 标记,用流式细胞仪检测 T 淋巴细胞的纯度。5.2 羟 基 荧 光 素 二 醋 酸 盐 琥 珀 酰 亚 胺 脂(CFSE)的标记取 5.1 步骤分选的细胞 1106 cells/mL,加入CFSE,于 37 避光孵育 20 min;加入预冷 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液,冰浴 5 min,用
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