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SN∕T 5212-2020 水松鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52122020水松鉴定方法Identification of Glyptostrobus pensilis (Staunton ex D. Don) K. Koch2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 52122020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛
2、海关。本文件主要起草人:于文涛、陈乃中、邵秀玲、虞赟、李明福、李佳、宋涛。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 52122020水松鉴定方法1 范围本文件规定了水松的鉴定方法。本文件适用于水松的鉴定。2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1种鳞 seminiferous scale裸子植物大孢子叶球由大孢子叶构成,呈螺旋状排列在纵轴上,上面较大而顶部肥厚的部分叫种鳞,也叫珠鳞或果鳞。一般认为珠鳞由大孢子叶发育而来。3.1.2苞鳞 bract scale裸子植物大孢子叶球由大孢子叶构成,呈螺旋状排列在纵轴上,
3、下面较小的薄片是苞鳞,一般认为苞鳞是失去生殖能力的大孢子叶。3.1.3顶芽 terminal bud在茎轴顶端形成的芽之总称,当幼胚进行极性分化时,最初形成的是顶芽,顶芽是最活跃的生长点之一。3.1.4腋芽 axillary bud侧芽之一种,特指从叶腋所生出的定芽。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。bp :碱基对(base pair)CTAB :十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)dNTP :脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)以正式出版文本为准2SN/T 52122020DNA :脱氧核糖核酸(d
4、eoxyribonucleic acid)OD :光密度值(optical density)Taq 酶:栖热水生菌 DNA 聚合酶。4水松基本信息中文名:水松学名:Glyptostrobus pensilis(Staunton ex D. Don)K. Koch异名:Glyptostrobus aquaticus(Antoine)R. ParkerGlyptostrobus heterophyllus(Brongn.)Endl.Glyptostrobus sinensis A. HenrySabina aquatica AntoineTaxodium japonicum var. hetero
5、phyllum Brongn.Taxodium sinense J. ForbesThuja pensilis Staunton ex D. Don英文名:Chinese Swamp Cypress, Chinese Water Fir分类地位:隶属杉科 Taxodiaceae,水松属 Glyptostrobus Endl.。水松属为单型属,即水松属内仅水松一种。水松其他信息参见附录 A。5方法原理水松可能以球果、种子、植株残体、植物标本和幼苗等形式进出境。水松球果、种子和叶等形态特征及标准 DNA 条码是鉴定该种的主要依据。其中球果、种子和叶片等形态特征均完整时,以形态特征作为鉴定依据;种子
6、或叶片等形态特征不完整的植物组织,以形态特征作为参考,以分子特征作为鉴定的主要依据。由于水松属为单型属,鉴定为水松属即为鉴定为水松。6设备和试剂6.1 设备及器具体视显微镜、电子天平、放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、指形管、培养皿、白瓷盘、棉花、样品袋、标本夹、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器(2 L,10 L,20 L,100 L,200 L,1000 L) 、离心管(2 mL) 、PCR 反应管(0.2 mL,0.
7、5 mL) 。6.2 试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 、Taq 聚合酶、10PCR 缓冲液、防虫剂、樟脑精、干燥剂。采用改良 CTAB 法提取试剂(参见附录 B) 。以正式出版文本为准3SN/T 521220207实验室检测选择现场检疫截获的原始样品的一部分为待检样品,该样品数量(株数或质量)的 1/2 至 3/4(较少样品时)作为检验样品,剩余样品作为保存样品。送检样品不足 3 株或 1.0 kg 的全检。8鉴定方法8.1 形态学鉴定方法依据杉科和水松的形态特征、
8、水松属及其近缘属分属检索表(见附录 C) 、基于种子和果实形态特征的水松及其近似属种检索表(见附录 D)对疑似样品进行物种鉴定。8.1.1 杉科形态特征8.1.1.1 茎常绿或落叶乔木,树干端直,大枝轮生或近轮生。8.1.1.2 叶叶螺旋状排列,散生,很少交叉对生(水杉属) ,披针形、钻形、鳞状或条形,同一树上之叶同型或二型。8.1.1.3 球花球花单性,雌雄同株,球花的雄蕊和珠鳞均螺旋状着生,很少交叉对生(水杉属) ;雄球花小,单生或簇生枝顶,或排成圆锥花序状,或生叶腋,雄蕊有(29 个) (常 34 个)花药,花粉无气囊;雌球花顶生或生于去年生枝近枝顶,珠鳞与苞鳞半合生(仅顶端分离)或完全
9、合生,或珠鳞甚小(杉木属) ,或苞鳞退化(台湾杉属) ,珠鳞的腹面基部有 2 枚 9 枚直立或倒生胚珠。8.1.1.4 球果球果当年成熟,熟时张开,种鳞(或苞鳞)扁平或盾形,木质或革质,螺旋状着生或交叉对生(水杉属) ,宿存或熟后逐渐脱落,能育种鳞(或苞鳞)的腹面有 2 粒 9 粒种子。8.1.1.5 种子种子扁平或三棱形,周围或两侧有窄翅,或下部具长翅;胚有子叶 2 枚 9 枚。8.1.2 水松形态特征(参见附录 E)8.1.2.1 全株及茎乔木,高 8 m10 m,稀高达 25 m。生于湿生环境者,树干基部膨大成柱槽状,并且有伸出土面或水面的吸收根,柱槽高达 70 cm,干基直径达 60
10、cm120 cm,树干有扭纹;树皮褐色或灰白色而带褐色,纵裂成不规则的长条片;枝条稀疏,大枝近平展,上部枝条斜伸;短枝从二年生枝的顶芽或多年生枝的腋芽伸出,长 8 cm18 cm,冬季脱落;主枝则从多年生及二年生的顶芽伸出,冬季不脱落。8.1.2.2 叶叶多型:鳞形叶较厚或背腹隆起,螺旋状着生于多年生或当年生的主枝上,长约 2 mm,有白色气孔点,冬季不脱落;条形叶两侧扁平,薄,常列成二列,先端尖,基部渐窄,长 1 cm3 cm,宽以正式出版文本为准4SN/T 521220201.5 mm4 mm,淡绿色,背面中脉两侧有气孔带;条状钻形叶两侧扁,背腹窿起,先端渐尖或尖钝,微向外弯,长 4 mm
11、11 mm,辐射伸展或呈三列状;条形叶及条状钻形叶均于冬季连同侧生短枝一同脱落。8.1.2.3 球果球果倒卵圆形,长2 cm2.5 cm,径1.3 cm1.5 cm;种鳞木质,扁平,中部的倒卵形,基部楔形,先端圆,鳞背近边缘处有 6 个10 个微向外反的三角状尖齿;苞鳞与种鳞几全部合生,仅先端分离,三角状,向外反曲,位于种鳞背面的中部或中上部。8.1.2.4 种子种子椭圆形,稍扁,褐色,长 5 mm7 mm,宽 3 mm4 mm,下端有长翅,翅长 4 mm7 mm。8.1.2.5 幼苗子叶 4 枚 5 枚,条状针形,长 1.2 cm1.6 cm,宽不及 1 mm,无气孔线;初生叶条形,长约 2
12、 cm,宽 1.5 mm,轮生、对生或互生,主茎有白色小点。8.2 分子生物学鉴定方法8.2.1 样品的处理将需要提取 DNA 的水松植物材料(种子为 1 粒 2 粒,新鲜叶为 100 mg,硅胶干燥的叶为 10 mg) ,放入 2 mL 的 EP 管中,每个管内加 2 粒钢珠,加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min(30 次 /s) 。8.2.2核酸的制备采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的CTAB 法参见附录 B。PCR 级 DNA 溶液的 OD260/OD280 比值应为 1.71.9。8.2.3DNA 条形码片段扩增利用rbcL
13、基因的通用引物进行rbcL基因扩增,引物序列、PCR反应程序和PCR反应体系见附录F。8.2.4PCR 产物的检测取 PCR 产物 5 L,1.5% 琼脂糖凝胶电泳,核酸凝胶染料染色,在凝胶成像系统观察、拍照。rbcL 引物扩增可获得约 991 bp 的扩增片段。8.2.5测序与序列处理取剩余的 PCR 扩增产物 45 L,经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离,目的片段使用 DNA 产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑,对比峰图,判断序列方向,去除测序引物序列,两端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。8.2.6标准 DNA 条码水松
14、rbcL 基因序列 GenBank 登录号:MF893589、MF893590。以正式出版文本为准5SN/T 521220209结果判定9.1形态学结果判定以水松球果、种子和叶等形态特征为依据,符合第 8 章所描述的形态鉴定特征并符合水松属及其近缘属分属检索表(见附录 C) 、基于种子和果实形态特征的水松及其近似属种检索表(见附录 D)中水松特征的,可鉴定为水松。9.2分子生物学结果判定登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ,在 BLAST 结果中查看序列相似性最高(Max ident or Simi
15、larity )的物种,一般为与查询序列最接近的物种。当序列鉴定率最高物种为 Glyptostrobus pensilis 时,可作为水松的鉴定依据。杉科常见近似种基因序列表信息参见附录 G。10标本和样品的保存与处理10.1保存方法10.1.1标本保存将鉴定检出的水松植株压制成干标本,将鉴定检出的水松种子装入标本瓶内,加以标识,注明编号、中文名称、学名、科别、产地、货物名称、进出境日期,经手人签字后妥善保存。10.1.2样品保存保存样品按编号、中文名称、产地、进出境日期分别存放,并由经手人标识确认和样品管理员登记后,妥善保存。10.2保存时间检出的水松样品,妥善保存至少 6 个月。以正式出版
16、文本为准6SN/T 52122020附 录 A(资料性附录)水松其他信息A.1 学名考证水松的学名,自 A. Rehder 及 M. T. Masters 等人考证以来,长期以 Glyptostrobus pensilis (Staunt.) Koch 为有效学名。近来 J. Franco,H. E. Moore 及 S. G. Harrison 则主张用 G. lineatus (Poir.) Druce 为其有效学名。经胡秀英(in Taiwania 10 : 60-61. 1964)查考,她认为 A. Rehder 等人的意见正确。因1817 年 J. L. M. Poiret 发表 T
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