半理性设计提高甲酸脱氢酶%28Cb FDH%29活力及热稳定性.pdf
《半理性设计提高甲酸脱氢酶%28Cb FDH%29活力及热稳定性.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《半理性设计提高甲酸脱氢酶%28Cb FDH%29活力及热稳定性.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、研究论文半理性设计提高甲酸脱氢酶(CbFDH)活力及热稳定性倪晗朦,胡孟凯,张恒维,张显,潘学玮,饶志明,周楠迪(江南大学生物工程学院,江苏无锡2 1412 2)摘要:甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase,FD H)是NADH循环再生的最佳酶之一,广泛应用于食品、医药和化工等行业。但是野生型甲酸脱氢酶普遍存在酶活低、催化效率差等缺点,导致产品转化率较低,影响产品的工业化生产。为了获得具有更佳催化性能的甲酸脱氢酶,作者以博伊丁假丝酵母(Candidaboidini)来源的甲酸脱氢酶为模板,利用HOTSPOTWIZARDv3.1进行三维结构模拟预测,构建了P68G、Q 197 K
2、两个突变体,比酶活较野生型分别提高了11%和33%。这是由于P68G氨基酸残基侧链的苯环被氢取代,减少了甲酸盐底物进入口袋的空间位阻;而Q197K侧链酰胺基突变为胺丁基增强了酶的柔性。然而这两个突变点对甲酸脱氢酶的热稳定性产生了负面影响,因此在I239位引入半胱氨酸突变与C262构成二硫键以提高其热稳定性,最终获得一株热稳定性显著提高,比酶活较野生型提高31%、较I239C提高45%的突变株CbFDHQ197K/1239C。通过半理性预测蛋白质结构提高了甲酸脱氢酶的活力和热稳定性,为高效构建性能稳定、还原力强的甲酸脱氢酶提供了理论基础。关键词:甲酸脱氢酶;半理性设计:博伊丁假丝酵母;定点突变;
3、辅酶循环中图分类号:Q789Enhanced Activity and Thermal Stability of FormateDehydrogenase(CbFDH)via Semi-Rational Design文章编号:16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)10-0 0 0 1-0 8DOl:10.12441/spyswjs.20220322002NI Hanmeng,HU Mengkai,ZHANG Hengwei,ZHANG Xian,PAN Xuewei,RAO Zhiming,Z H O U Na n d i*(School of Biotechnology,Jiangna
4、n University,Wuxi 214122,China)Abstract:Formate dehydrogenase(FDH)is one of the most effective enzymes for NADHregeneration and is extensively utilized in the food,pharmaceutical and chemical industries.However,wild-type FDH often suffers from low enzyme activity and poor catalytic efficiency,result
5、ing in lower product conversion and hindering industrial production.In order to obtain FDHwith improved catalytic performance,FDH from Candida boidinii was used as a template andHOTSPOT WIZARD v3.1 was employed for three-dimensional structure simulation and prediction.收稿日期:2 0 2 2-0 3-2 2基金项目:国家重点研发
6、计划项目(2 0 2 1YFC2100900);国家自然科学基金项目(32 17 147 1,32 0 7 147 0);中国博士后科学基金资助项目(2 0 2 1M 6 912 8 0);江苏省博士后科研资助计划项目(2 0 2 1K296B);江苏高校优势学科建设工程资助项目和江苏高校品牌专业建设工程资助项目。*通信作者:周楠迪(197 4一),男,博士,教授,博士研究生导师,主要从事生物大分子的结构与功能、分子识别与生物分析、纳米生物技术等研究。E-mail:修回日期:2 0 2 2-0 4-2 2食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第10 期RESEARCHARTICLENI
7、Hanmeng,et al:Enhanced Activity and Thermal Stability of FormateDehydrogenase(CbFDH)via Semi-Rational DesignAnd 2 mutants,P68G and Q197K,were constructed.In comparison to the wild type,they exhibited11%and 33%higher enzyme activity,respectively.The improved activity was attributed to thereplacement
8、of the phenyl ring on the side chain of residue P68G by hydrogen,reducing sterichindrance for formate substrate entry,while the mutation of the side chain amide group in Q197K toaminobutyl enhanced the flexibility of the enzyme.However,these 2 mutations negatively affectedthe thermal stability of FD
9、H.Hence,a cysteine mutation was introduced at position I239 to form adisulfide bond with C262,thereby enhancing the thermal stability.Ultimately,the mutant strainCbFDH Q197K/1239C was obtained,which exhibited remarkable improvement in thermal stability,displaying a 31%increase in enzyme activity com
10、pared to the wild-type and a 45%increasecompared to I239C.This study demonstrates that the activity and thermal stability of FDH could beenhanced through semi-rational protein structure prediction,providing a reliable theoreticalfoundation for the efficient construction of FDH with stable performanc
11、e and strong reducing power.Keywords:formate dehydrogenase,semi rational design,Candida boyding,site directed mutation,coenzyme cycleNAD+依赖型甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase,FDH,EC 1.2.1.2)属于 D-2-羟基酸脱氢酶超家族,是脱氢酶合成光学活性化合物中NADH再生酶之一 2 ,常见于甲基营养型微生物,例如可利用甲醇的一些酵母及其他真菌、细菌等 3-7 。甲酸脱氢酶可以将甲酸盐底物的醛基或羰基氧化成CO2,并利用NAD+作为
12、辅因子接受和转移氢从而产生大量NADH8,故而该酶常被用于不对称合成手性化合物过程中NADH的原位再生 9-10 。早在1995年,甲酸脱氢酶就已经被用于偶联亮氨酸脱氢酶以实现L-叔亮氨酸的工业化生产,还被用于多种非天然氨基酸、手性醇及各种衍生物 12-13。相比于葡萄糖脱氢酶和亚磷酸脱氢酶等介导的辅酶再生体系,甲酸脱氢酶的共反应产物CO2更容易从体系中分离出来,并且不会引起反应体系pH的剧烈变化,大大降低了生产过程中使用酸碱的成本。然而野生型的甲酸脱氢酶具有稳定性差、酶活低等缺点,往往会造成反应体系中辅酶NADH供应不足,进而使产品转化效率降低。因此提高甲酸脱氢酶的稳定性和增强其对NAD+/
13、NADH辅酶再生的催化能力成为当下一大研究热点。随着基因工程技术日渐成熟,多种不同来源的甲酸脱氢酶在大肠杆菌中被克隆表达14,其中博伊丁假丝酵母(Candida boidini)来源的甲酸脱氢酶研究最为广泛。定向进化技术是甲酸脱氢酶改造的常用手段之一,通过构建序列多样的突变文库并从中筛选出符合预期效果的突变体。尽管高通量筛选JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 10 2023甲酸脱氢酶的方法已有报道 15-16,但正向突变体的筛选过程仍非常复杂且耗时。近年来,随着蛋白质工程技术的迅速发展,越来越多的蛋白质三维结构被精确解析
14、 17-18。研究者们针对甲酸脱氢酶辅酶特性、酶活力和稳定性等方面进行分子改造,大量关键氨基酸残基被挖掘以提高FDH性能 19-2 0 。作者前期基于CbFDH二级结构计算预测,构建了A10C、I239C突变株,通过引人半胱氨酸残基形成二硫键大大提高了CbFDH的热稳定性 2 1。Bulut等对博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶的Phe285、G ln 2 8 7和His311位保守氨基酸残基进行定点突变,验证了其作为热稳定性改造靶点的研究潜力 2 。Q197和P68位氨基酸残基被认为是影响甲酸脱氢酶辅酶再生能力的重要位点。随着蛋白质理性设计研究的深人,大量基于生物信息学和人工智能算法的蛋白质预测
15、工具被用于探索蛋白质结构和氨基酸残基特性对酶的影响 2 3。例如,Sumbalova等设计出HotSpotWizardweb服务器(http:/loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/),其主要功能是针对活性位点和底物通道中的具有改造潜能的氨基酸残基,计算预测诱变“热点”之后对“热点”进行饱和突变和性能筛选,以达到提高蛋白质的稳定性、催化活性、底物特异性和对映体选择性的目的 2 4。作者首先将博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(CbFDH)在大肠杆菌中异源表达,然后利用HOTSPOT WIZARD v3.1(https:/loschmidt.chemi.muni
16、.cz/hotspotwizard)对 CbFDH氨基酸序列建模预研究论文倪晗,等:半理性设计提高甲酸脱氢酶(CbFDH)活力及热稳定性测,以期通过半理性设计优化CbFDH的酶活及其热稳定性。经筛选,P68G、Q 197 K 突变株比酶活较野生型分别提高11%和33%,但突变体热稳定性明显降低,因此结合前期工作进一步引人二硫键以提高突变体热稳定性,最终获得一株热稳定性显著提高,比酶活较野生型提高31%、较12 39C提高45%的突变株CbFDHQ197K/239C。材料与方法1.1菌株、质粒与试剂选用大肠杆菌EscherichiacoliBL21(D E3)作为表达宿主,表达Candidabo
17、idini来源的FDH基因Cbfdh(G e n Ba n k 登录号:AJ011046.2),含有Cbfdh的pUC19-Cbfdh质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成,并根据大肠杆菌表达宿主的密码子偏好性进行密码子优化。pET-28a购自Novagen公司,带有卡那霉素抗性基因。本实验所用酶制剂均购自诺唯赞公司(中国南京);Bradford蛋白质浓度试剂盒及卡那霉素:购自生工(上海)生物工程有限公司;质粒快速提取试剂盒:购自Generay公司;胰蛋白、酵母提取物及琼脂粉:购自OXOID(英国);引物名称Cbfdh-FCbfdh-R28a-F28a-RP68G-FP68G-RG117V-FG
18、117V-RV120S-FV120S-RA172V-FA172V-RY196K-FY196K-RQ197K-FQ197K-RA229S-FA229S-RI239C-F1239C-R注:斜体为酶切位点,下划线为同源序列,加粗为突变点。其他试剂购自国药集团(中国上海)。1.2研究方法1.2.1重组表达载体构建以 pUC19-Cbfdh为模板利用Cbfdh-F/Cbfdh-R引物PCR扩增获得Cbfdh基因,以pET-28a为模板利用2 8 a-F/28a-R引物反向PCR扩增获得线性化载体。基因片段与线性化载体通过同源重组方式连接,导人大肠杆菌E.coliBL21中,构建重组大肠杆菌BL21/pE
19、T28a-Cbfdh。以pET28a-Cbfdh为模板,设计点突变引物,通过反向PCR引入突变点,构建一系列突变体。带有突变基因的重组质粒送金唯智公司测序,基因比对完全正确后标记保藏。本研究所用引物如表1所示。1.2.2重组酶的表达及纯化重组菌经平板活化,挑单克隆接种于含有50 mg/L卡那抗生素的10 mL液态 Luria-Bertani(LB)培养基中,37 、2 0 0 r/min培养10 h。按接种体积分数1%转接至50 mLLB培养基中,37、2 0 0 r/min继续培养2 h,加人终浓度为0.8 mmol/L的 IPTG,16、18 0 r/m in 诱导 10 h。然后4、8
20、0 0 0 r/min离心10 min收集菌体,细胞洗涤2 次后悬浮于0.0 5mol/LPBS缓冲液(pH7.5)中,使用超声波破碎仪进行细胞破碎。细胞破碎液表1本实验所用引物Table 1Primers used in this study引物序列(5-3)GGTCGCGGATCCGAATTCATGAAGATCGTTTTAGTCTTATATGATGATCCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCTTATCGTGTTTACCACCACCACCACCACCACTAACTCGAGGATCCGGCTGCCGATCTTCATGAATTCGGATCCGCGACCCATTTGATTA
21、TCATTACAACTGGATTCCATCCTGCTTATATCACTAAGGATAAGCAGGATGGAATCCAGTTGTAATGATAATATCGGCATCTGTTGGAAGTTACCGTTTCTAATGTTGTCTCTAGAGACAACATTAGAAACGGTAACTTCCAAGTTCTAATTCTGTCTCTGTTGCAGAACACGGCAACAGAGACAGAATTAGAACCGGTAACTTCCAAAACCTATCGCCACCATTGGTGTTGGTAGAATTGGTTACGTAACCAATTCTACCAACACCAATGGTGGCGATAGGAATTATTATACTACGATA
22、AACAAGCTTTACCAAAAGATATCTTTTGGTAAAGCTTGTTTATCGTAGTATAATAATTCGAATTATTATACTACGATTATAAAGCTTTACCAAAAGATATCTTTTGGTAAAGCTTTTATATCGTAGTATAATAATTCCAGTTAATTCTCCATTACACGCTGGTACAATGTAATGGAGAATTAACTGTAACTATATCAGCTTGGGGGTACAAAAGGTTTATGTAACAAGGAATTATTGCAATAATTCCTTGTTAACATAAACCTTTTGTACC食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第10 期3R
23、ESEARCHARTICLENI Hanmeng,et al:Enhanced Activity and Thermal Stability of FormateDehydrogenase(CbFDH)via Semi-Rational Design10000r/min、4下离心10 min,去除沉淀,上清液即为粗酶液。蛋白质纯化方法使用镍柱亲和层析法 19,粗酶液经0.2 2 m滤膜过滤后上样至HisGraviTrap柱,用MO缓冲液(0.0 2 mol/LTris、0.5m o l/L Na Cl,p H为7.40 0.0 5)进行柱平衡,然后用M300缓冲液(0.02 mol/L Tri
24、s、0.5 m o l/L Na C l,0.5 m o l/L 咪唑,pH为7.40 0.0 5)进行梯度洗脱,洗脱梯度为2 0%、8 0%和10 0%。纯蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定分析。1.2.3酶活及蛋白质浓度测定甲酸脱氢酶酶活测定采用紫外分光光度法,反应溶液由0.0 5mol/LPBS缓冲液(pH7.5)配制,包括16 7 mmol/L甲酸钠和1.6 7 mmol/LNAD+溶液。取1.48 mL甲酸钠溶液置于石英比色皿,依次加人8 0 LNAD+溶液,10L适当稀释后的纯酶液,在30 条件下启动反应并计时,每30 s记录OD340变化值。根据不同浓度NADH的OD340绘制
25、标准曲线计算每分钟产生的NADH量。甲酸脱氢酶酶活力单位定义:每分钟消耗或生成1mol NADH所需要的酶量。蛋白质质量浓度测定使用Bradford蛋白质测定试剂盒。1.2.4酶学性质分析最适反应温度测定:用pH7.5.0.5mol/L的PBS缓冲液将纯酶稀释到适合浓度后加人到预热好的反应体系中反应,按1.4中方法计算比酶活,反应温度梯度设置为2 5、30、35、40、45、50、55、6 0、6 5、7 0。初始酶活为10 0%,计算不同温度下突变体酶的相对比酶活。最适反应pH测定:将突变体纯酶用不同pH缓冲液稀释到适合浓度后加人至预热好的相应pH体系中反应,使用的缓冲液如下:磷酸氢二钠-柠
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 半理性设计提高甲酸脱氢酶%28Cb FDH%29活力及热稳定性 理性 设计 提高 甲酸 脱氢酶 28 Cb FDH 29 活力 热稳定性
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。