Trim37过表达通过激活Wnt_β-catenin通路促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT.pdf
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1、现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.22.4147:Trim37过表达通过激活Wnt/-catenin通路促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT何凡,阮剑武汉市第一医院甲乳外科,湖北武汉430 0 33【摘要】目的:探讨Trim37通过Wnt/-catenin通路对乳腺癌发展的影响及其作用机制。方法:实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和Western blot检测Trim37在乳腺癌组织、癌旁正常组织、人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人正常乳腺上皮细胞
2、(MCF-10A细胞)中的表达。pcDNA-Trim37或Trim37siRNA转染MCF-7细胞后,CCK-8法检测过表达及下调Trim37对细胞增殖的影响,Transwell实验检测过表达及下调Trim37对细胞侵袭的影响,细胞划痕愈合实验检测过表达及下调Trim37对细胞迁移的影响,Western blot检测过表达及下调Trim37对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-c a d h e r i n 和Snail)及-catenin、Cy c l i n D 1、P-ERK、p-A K T 和
3、p-FAK蛋白表达的影响。Wnt/-catenin通路抑制剂(XAV939)作用MCF-7细胞后,检测MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移和EMT能力。结果:与癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中Trim37mRNA和蛋白表达量明显升高(P0.01);与MCF-10A细胞相比,MCF-7细胞中Trim37mRNA和蛋白表达量明显升高(P0.01)。过表达Trim37促进了MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移与EMT,-catenin和CyclinD1蛋白表达量明显上升;下调Trim37抑制了MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移与EMT,-catenin 和CyclinD1蛋白表达量明显降低,过表达及下调Trim37对
4、ERK、A K T 和FAK蛋白的磷酸化水平没有影响。XAV939作用MCF-7细胞后抑制了过表达Trim37对MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的促进作用。结论:过表达Trim37通过激活Wnt/-catenin通路诱导EMT来促进乳腺癌的发展。【关键词】Trim37;Wnt/-catenin;乳腺癌;EMT【中图分类号】R737.9【文章编号】16 7 2-49 9 2-(2 0 2 3)2 2-4147-0 7Overexpression of Trim37 promotes the proliferation,invasion,migration and EMT ofbreast
5、cancer cells by activating the Wnt/-catenin pathwayHE Fan,RUAN JianDepartment of Thoracic and Breast Surgery,Wuhan First Hospital,Hubei Wuhan 430033,China.Abstract Objective:To investigate the effect of Trim37 through Wnt/-catenin pathway on the development ofbreast cancer and its mechanism.Methods:
6、The expression of Trim37 in breast cancer tissues,adjacent normal tis-sues,MCF-7 cells and MCF-10A cells were detected by RT-qPCR and Western blot.MCF-7 cells were trans-fected with pcDNA-Trim37 or Trim37 siRNA,the effects of overexpression and downregulation of Trim37 on cell pro-liferation were de
7、tected by CCK-8 assay,the effects of overexpression and downregulation of Trim37 on cell invasionwere detected by Transwell assay,and the effects of overexpression and downregulation of Trim37 on cell migrationwere detected by scratch healing assay.Western blot was used to detect the effects of over
8、expression and downregula-tion of Trim37 on the expression of EMT-related proteins(E-cadherin,N-cadherin and Snail),-catenin,Cy-clinD1,p-ERK,p-AKT and p-FAK in cells.Wnt/-catenin pathway inhibitor(XAV939)acted on MCF-7cells,the proliferation,invasion,migration,and EMT of MCF-7 cells were detected.Re
9、sults:The expression ofTrim37 mRNA and protein in breast cancer tissues was significantly higher than that in paracancer tissues(P0.01).Compared with MCF-10A cells,the Trim37 mRNA and protein expression levels in MCF-7 cells were sig-nificantly increased(P 0.01).The overexpression of Trim37 promoted
10、 the proliferation,invasion,migration andEMT of MCF-7 cells,the protein expression levels of -catenin and CyclinD1 increased significantly.While the【收稿日期】202203-22【基金项目】湖北省自然科学基金(编号:2 0 18 CFC831)【作者简介】何凡(19 7 9),男,湖北人,主治医师,主要从事甲状腺乳腺外科方面的研究。E-mail:【通信作者】阮剑(19 7 7 一),男,湖北人,副主任医师,主要从事甲状腺乳腺外科方面的研究。E-ma
11、il:【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 2-0 5-2 5D0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.22.009Modern Oncology 2023,31(22):4147-4153:4148 downregulation of Trim37 inhibited the proliferation,invasion,migration and EMT of MCF-7 cells,the protein expres-sion levels of -catenin and CyclinD1 decreased significantly,while the
12、overexpression and downregulation of Trim37had no effect on the phosphorylation levels of ERK,AKT and FAK proteins.XAV939 inhibited the proliferation,inva-sion,migration and EMT of MCF-7 cells after overexpressing Trim37.Conclusion:Overexpression of Trim37 pro-motes the development of breast cancer
13、by activating the Wnt/-catenin pathway to induce EMT.Key words Trim37,Wnt/-catenin,breast cancer,EMT乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是女性肿瘤患者死亡的第二大原因 。乳腺癌的发病是激素、遗传、病毒、营养因素、环境因素和心理因素综合作用的结果。虽然乳房X光检查和治疗可以降低死亡率,但侵袭性乳腺癌具有高增殖、高移动性、高侵袭性等特点,降低了乳腺癌患者5年生存率2 。转移是一个多步骤的过程,包括人侵、增殖、迁移和通过黏附附着点克隆扩展3。但是,具体的调控机制还不清楚。因此,寻找新的转移分子标记物是
14、发现新的治疗靶点和改善乳腺癌预后的关键。转移是癌症进展过程中的一个标志,上皮间质转化(epithelialm e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n,EM T)是肿瘤转移的关键步骤,能够促进肿瘤细胞侵袭。E-cad-herin等上皮标志物的减少和N-cadherin、波形蛋白等间质标志物的表达增加使肿瘤细胞具有较高的扩散潜能4-5一些调控EMT的关键蛋白已经被发现,如COX2和OPN6然而,复杂的分子网络仍在研究中。研究发现Trim37包含一个无名指结构域,在乳腺癌中,Trim37上调并可通过单泛素H2A促进肿瘤生长,发挥其致癌作用7 。另外Trim37
15、促进了胰腺癌细胞的生长和迁移8 。在结直肠癌细胞中,敲低Trim37可以抑制肿瘤细胞增殖和发生9 。然而,Trim37在乳腺癌MCF细胞中的表达及其作用机制仍有待研究。因此我们在本实验中主要通过分析Trim37调控乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的作用机制,进一步阐明Trim37在乳腺癌发展过程中的重要作用。1材料与方法1.1 主要材料从本医院选取人乳腺癌组织(45例)和癌旁正常组织(36 例),样本的采集经过了患者及其家属的同意,采集的样本立即保存在液氮中用于后续实验。人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A细胞)购自中国科学院上海细胞库;DMEM(Du
16、lbeccos-modified Eagles me-dium)培养基、胰蛋白酶及其血清均购自美国Gibco公司;CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;Tran-swell小室购自美国Corning公司;抑制剂XAV939购自美国Sellect 公司;GAPDH,E-cadherin、N-c a d h e r i n、P-FA K、p -AKT、p-ERK 和Snail抗体购自英国Abcam公司;pcDNA-Trim37和Trim37siRNA重组质粒购自北京擎科生物有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养MCF-7细胞和MCF-10A细胞用含10%FBS、1%青霉素-链霉素的DME
17、M培养基培养,培养皿置于37、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中,每2 天更换一次培养基,细胞长满后加人0.2 5%胰酶进行消化和传代培养。1.2.2细胞转染培养的MCF-7细胞稀释后按110/孔的密度接种于12孔板,观察细胞汇合至7 5%时,用无FBS的DMEM培养基覆盖细胞单层,细胞分为:Control组、pcDNA-3.1(+)组、何凡,等Trim37过表达通过激活Wnt/-catenin通路促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMTpcDNA-Trim37 组;pcDNA-Trim37+XAV939 组。siRNANC组、Trim37 siRNA组。按照Turbofect试剂转染说明书将重
18、组质粒转染MCF-7细胞,培养12 h后弃培养液,添加新鲜的DMEM培养基,持续培养48 h后收取细胞样品用于后续实验。1.2.3CCK-8法检测细胞活力培养的MCF-7细胞稀释后按110/mL的密度接种于9 6 孔板,细胞置于37、5%CO2、饱和湿度培养箱中生长,显微镜观察皿底细胞汇合至7 0%8 0%时,用Turbofect试剂进行转染,培养箱中孵育48 h后每孔细胞中添加10 LCCK-8工作液,置于细胞培养箱持续培养2 h,在450 nm下读取各孔细胞的吸光值。1.2.4细胞侵袭实验培养的MCF-7细胞稀释后按110/孔的密度接种于12孔板,Transwell上室中加人10 0 L融
19、化的Matrigel基质,细胞转染48 h后制成细胞悬液,并将110 5个细胞悬液加入细胞上室,下室中添加50 0 L含10%FBS的DMEM培养基,培养2 4h,加人PBS清洗3次,下室中加入4%多聚甲醛进行固定,用PBS进行洗涤,用0.1%结晶紫染色,2 0 min后在显微镜下随机选取5个视野中的细胞进行观察,用细胞侵袭数目反映细胞侵袭能力。1.2.5细胞划痕愈合实验培养的MCF-7细胞转染48 h后制成细胞悬液,按照2105个/孔的密度接种在6 孔板中,在37、5%C02、饱和湿度培养箱中生长。观察皿底细胞长满后,取2 0 0 L无菌移液管,在细胞单层进行线性划痕,在显微镜下观察并拍照,
20、48h后观察迁移细胞的距离,并通过ImageJ软件测定细胞迁移的距离。1.2.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)使用Trizol法提取细胞和组织总RNA,将收取的细胞RNA样和组织样本中加人Trizol,提取总RNA后通过紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度,选取A260/280值在1.8 2.0范围内的RNA样利用 Takara反转录试剂盒反转为cDNA。以反转得到的 cDNA为模板,再利用 SYBR real-time试剂盒进行RT-qPCR,每组重复3个复孔,定量结果以GAPDH为内参,通过2-Ci法进行分析。引物序列如下:Trim37-F:TCAGCTGTATTAGGCGCTGG,T
21、rim37-R:ACTTCTTCTGCCCAACGACA;GAPDH-F:CAAGGACCTCTACGCCAACAC,GAPDH-R:TGGAGGCGCGATGATCTT。1.2.7Western blot收取转染成功的细胞蛋白样品,每孔细胞加人6 0 uLRIPA裂解液进行充分裂解,裂解完成后通过BCA试剂盒进行蛋白定量,各组取6 0 g蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,蛋白分离后转移到PVDF膜上。转膜完成后用5%的脱脂奶粉过夜封闭,加入相应的一抗过夜孵育,TBST清洗5次,清洗干净后加入相应的二抗于室温孵育2 h,TBST清洗5现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期
22、次,避光条件下滴加蛋白发光液进行蛋白显影,并利用 ImageJ软件进行结果分析。1.3统计学分析收集的实验数据通过Graphpadprism5.0软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,当P0.05时,表示差异显著或极显著。2结果2.572.01.51.00.50.0MODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.222.1Trim37在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达量由图1A和1B结果可知,和癌旁正常组织相比,乳腺癌组织中Trim37mRNA和蛋白表达量明显上升(P0.01)。由图1C和1D结果可知,和MCF-10A细胞相比,MCF-
23、7细胞中Trim37mRNA和蛋白表达量明显升高(P0.01)。以上结果表明Trim37在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7细胞中表达上调。B2.57NormalBreastParacancercancertissuetissueTrim37GAPDH:4149.D2.01.51.00.50.0MCF-10AMCF-10AMCF-7Trim37GAPDH图1Trim37在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中的表达量A:RT-qPCR检测 Trim37在癌旁正常组织和乳腺癌组织中的 mRNA表达量;B:Western blot 检测 Trim37在癌旁正常组织和乳腺癌组织中的蛋白表达量;C:RT-qPCR检测Tr
24、im37在MCF-10A和MCF-7细胞中的mRNA表达量;D:W e s t e r n b lo t 检测Trim37在MCF-10A和MCF-7细胞中的蛋白表达量;*P0.01。Fig.1Expression level of Trim37 in breast cancer tissues and cellsA:RT-qPCR was used to detect the mRNA expression level of Trim37 in adjacent normal tissues and breast cancer tissues.B:Western blot was used
25、to detectthe protein expression of Trim37 in adjacent normal tissues and breast cancer tissues.C:mRNA expression level of Trim37 in MCF-10A and MCF-7 cellswas detected by RT-qPCR.D:Western blot was used to detect the protein expression of Trim37 in MCF-10A and MCF-7 cells,*P0.01.2.2过表达及下调Trim37对 MCF
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