Toll样受体4在A型流感病毒诱导的小鼠肺部炎症中的作用机制.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(8):1357-1365杂志网址:http:/Toll样受体4在A型流感病毒诱导的小鼠肺部炎症中的作用机制*黄家望1,马心悦1,凡博砚2,刘卓琳1,王康宇2,冯芷莹2,孙贵香2,李玲2(1湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208;2湖南中医药大学中医学院,湖南 长沙 410208)摘要 目的:通过研究A型流感病毒(influenza A virus,IAV)诱导的野生型(wild-type,WT)和Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)敲除型(T
2、LR4del)C57BL/6小鼠肺部炎症差异,探讨TLR4在IAV诱导的肺部炎症中的作用机制。方法:设立WT组和TLR4del组,用IAV滴鼻感染WT小鼠和TLR4del小鼠以构建小鼠肺炎模型,每组各48只。分别在感染0、1、3、5、7和9 d处理动物。常规法检测小鼠体质量,计算肺指数、脾指数和胸腺指数。使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法检测不同时间点各组小鼠肺组织病理变化。ELISA实验检测小鼠支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、IL-6和IL-8的含量
3、,探讨不同时间点各组小鼠炎症因子的分泌情况。RT-qPCR、免疫组化和Western blot检测肺组织中TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)的mRNA和蛋白表达情况,进一步探讨TLR4在IAV感染诱导的小鼠肺炎模型中的作用机理。结果:与WT组小鼠相比,TLR4del组小鼠在感染3 d后的体质量、脾指数和胸腺指数显著上升(P0.05),肺指数显著下降(P0.05)。感染3 d后,与
4、WT组小鼠相比,TLR4del组小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8含量显著下降(P0.05)。HE染色结果显示,敲除TLR4能减轻IAV感染的小鼠肺组织病理损伤。RT-qPCR、免疫组化和Western blot结果显示,与WT组相比,感染3 d后,TLR4del组小鼠肺组织MyD88和TRAF6的mRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.05)。结论:IAV感染诱导小鼠肺部炎症的损伤机制可能与TLR4介导的TLR4-MyD88-TRAF6信号通路有关。关键词 A型流感病毒;肺部炎症;Toll样受体4;髓样分化因子88;肿瘤坏死因子受体相关因子6中图分类号 R563.1;
5、R373.1;R363 文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.002Role of Toll-like receptor 4 in pulmonary inflammation induced by influenza A virusHUANG Jiawang1,MA Xinyue1,FAN Boyan2,LIU Zhuolin1,WANG Kangyu2,FENG Zhiying2,SUN Guixiang2,LI Ling2(1College of Integrated Traditional Chinese and Western Me
6、dicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2College of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China.E-mail:;)ABSTRACT AIM:To explore the mechanism of Toll-like receptor 4(TLR4)in the pulmonary inflammation induced by influenza A virus
7、(IAV)based on animal experiments of wild-type(WT)and TLR4 deletion type(TLR4del)C57BL/6 mice.METHODS:Two groups of mice,namely WT and TLR4del,were established.The mice in both groups were intranasally infected with IAV to construct pneumonia models,with 48 mice in each group.The animals were treated
8、 on days 0,1,3,5,7 and 9 after infection.The body mass,lung index,spleen index and thymus index were measured or 文章编号 1000-4718(2023)08-1357-09 收稿日期 2023-04-03 修回日期 2023-06-03*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.81973670);湖南省自然科学基金项目(No.2020JJ5418);湖南中医药大学中西医结合病原生物学湖南省重点实验室开放基金项目(No.2022KFJJ02);湖南中医药大学研究生创新项目(No.2
9、022CX63)通讯作者 李玲 Tel:0731-88459735;E-mail:;孙贵香 Tel:0731-88458217;E-mail:1357calculated by routine methods.The pathological changes of the mouse lung tissues at different time points were observed by hematoxylin-eosin(HE)staining.The levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1),IL-6 and
10、IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid were detected by ELISA,in order to examine the secretion of inflammatory factors at different time points.The mRNA and protein expression levels of TLR4,myeloid differentiation factor 88(MyD88)and tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)in th
11、e mouse lung tissues were detected by RT-qPCR,immunohistochemistry and Western blot,in order to further clarify the mechanism of TLR4 in pulmonary inflammation induced by IAV infection.RESULTS:Compared with WT group,the mice in TLR4del group showed significant increases in the body mass,spleen index
12、 and thymus index(P0.05),and a significant decrease in the lung index(P0.05)3 d after IAV infection.At the same time,the levels of TNF-,IL-1,IL-6 and IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased in TLR4del group(P0.05).The HE staining results indicated that TLR4 deletion cou
13、ld effectively attenuate the pathological damage in the lung tissues of IAV-infected mice.The results of RT-qPCR,immunohistochemistry and Western blot showed that,compared with WT group,the mRNA and protein expression levels of MyD88 and TRAF6 in the lung tissues of the mice in TLR4del group were si
14、gnificantly reduced 3 d after infection(P0.05).CONCLUSION:The injury mechanism of IAV-induced pulmonary inflammation in mice may be related to the TLR4-MyD88-TRAF6 signaling pathway mediated by TLR4.KEY WORDS influenza A virus;pulmonary inflammation;Toll-like receptor 4;myeloid differentiation facto
15、r 88;tumor necrosis factor receptor-associated factor 6A型流感病毒(influenza A virus,IAV)属于RNA病毒家族中的正黏病毒科(Orthomyxoviridae),是全球主要健康问题病原体,在反复流行和大暴发流行期间造成高发病率和死亡率1-2。流感每年都在不断演变,出现新的抗原变异,导致季节性暴发3。西班牙IAV在1918年期间大流行,感染了全球约1/3的人口,造成超过4 000万人死亡4-5。随着现代医学的发展和卫生习惯的改善,流感大流行爆发的概率大大降低。但目前全球范围内,IAV感染仍是一个重要的发病与致死率成因。随
16、着抗病毒药物的广泛应用,病毒耐药性的迅速出现、耐药病毒的易传播性和中枢神经系统副作用的发生,抗病毒药物的广泛使用受到了限制6-9。尽管正在开发疫苗来预防感染,但了解疾病的分子机制以开发针对感染个体的治疗方法也很重要。因此,了解流感感染期间的宿主细胞调节机制有可能为抗流感治疗提供新的宿主细胞识别靶标。流感病毒感染能激活肥大细胞,释放胰蛋白酶、组胺和-干扰素等炎症介质,进而导致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的发生10-12。炎症反应的启动取决于对病原体保守分子的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)13。据报道,Toll样受体(T
17、oll-like receptors,TLRs)是主要识别流感病毒的PRR14-15。TLR4是其中典型的 PRR,主要表达于单核细胞和巨噬细胞中,可识别介导肺部炎症反应的内源性和外源性朊病毒炎症因子。研究表明,TLR4介导的信号通路活化是感染流感病毒宿主细胞的重要因素之一,当病毒入侵机体引发氧化应激时,可以通过TLR4下游的先天免疫途径发出信号进而可以激活TLR4-肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)-核因子 B(nuclear factor-B,NF-B)信号通路,导致ALI,同时TL
18、R4-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)-p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路在流感病毒的渗透性和组织嗜性中发挥着重要作用16-18。基于这些研究,我们拟通过对野生型(wild-type,WT)小鼠和 TLR4 敲除型(TLR4 deletion type,TLRdel)小鼠构建 IAV 肺炎模型,探讨 TLR4-MyD88-TRAF6信号通路在流感病毒复制中的作用。材料和方法1实验试剂及设备Trizol Reagent(杭州新景生物试剂开
19、发有限公司);逆转录试剂盒(上海近岸科技有限公司);RT-qPCR试剂盒(上海近岸科技有限公司);引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列见表1;肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)ELISA试剂盒(E-EL-M3063)、白细胞介素 1(interleukin-1,IL-1)ELISA试剂盒(E-EL-M0037c)、IL-6 ELISA试剂盒(E-EL-M0044c)和 IL-8 ELISA 试剂盒(E-EL-M6008)均为Elabscience产品;GAPDH兔多克隆抗体(10494-1-AP)、TLR4 兔多克隆抗体(19811-1-AP)、
20、MyD88 兔多克隆抗体(23230-1-AP)、TRAF6 兔多克1358隆抗体(14424-1-AP)和 HRP 标记的羊抗兔抗(SA00001-2)均为Proteintech产品。PCR 仪(Biometra);多功能酶标仪(BioTek);SDS-PAGE 电泳及转膜设备(Bio-Rad);微量移液器(Thermo);微量冷冻离心机、DK-S23电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备公司)。2实验动物从南京大学模型动物研究中心购买68周龄的SPF级 WT和 TLR4del C57BL/6小鼠,雌雄各半,共 88只,体质量 1618 g,适应性饲喂 12 d,饲养于湖南中 医 药 大 学 动
21、物 实 验 中 心(编 号:SLBH-202205310006),动物质量证书为 SYXK(湘)2013-0005。动物实验方案均通过湖南中医药大学动物伦理委员中心批准(编号:LLBH-202205310006)。3主要方法3.1病毒制备和定量IAV(A/PR/8/34)由湖南师范大学病毒研究实验室惠赠,储存在80 冰柜中备用。经10日龄鸡胚尿囊腔接种、培养、传代,血凝效价1 640以上者供实验用。将灭菌盐水尿囊液中的病 毒 稀 释 至 50 LD50/0.1 mL(MOI=2.0),备 用 于冰中19。3.2实验分组及干预方式实验分为 WT 组和TLR4del组,每组各 48 只。参考课题组
22、前期造模方法19,每只小鼠鼻内感染0.1 mL的50 LD50病毒量,每天观测小鼠活动状况和体重等情况并在感染当天、第1天、第3天、第5天、第7天和第9天分别处理动物,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺组织进行检测。3.3对 WT 和 TLR4del C57BL/6 小鼠进行基因型鉴定随机选择WT和TLR4del C57BL/6小鼠,取其尾部组织(0.30.5 cm)切成小块,使用碱裂解法提取组织 DNA。加入 A 溶液(25 mmol/L NaOH 和 2 mmol/L EDTA)100 L,在95 加热23 h,然后加入B溶液
23、(40 mmol/L Tris HCl,pH 7.6)100 L,混合均匀,14 000g离心5 min,取上清液即为提取的DNA。使用1 g总DNA作模板进行PCR,最终反应体积为20 L。反应条件:95 4 min;95 30 s,60 30 s,72 30 s;然后72 10 min至反应结束。扩增后,在1.7%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。3.4ELISA实验检测小鼠BALF中炎症因子表达情况收集小鼠 BALF,根据 ELISA试剂盒说明书,检测小鼠BALF中TNF-、IL-1、IL-6和IL-8的水平。3.5苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠肺组织病理
24、变化HE染色在石蜡包埋的小鼠肺切组织片上进行。肺组织切片依次在 100%和95%乙醇中再水化,然后进行二甲苯脱蜡。用蒸馏水冲洗后,用苏木精染色,随后在伊红中复染,然后用95%和100%乙醇连续脱水,封片至盖玻片上并于显微镜下观察。3.6RT-qPCR 检测小鼠肺组织 TLR4、MyD88 和TRAF6的mRNA表达情况使用Trizol提取组织总RNA,分光光度计检测 RNA 浓度,按照逆转录试剂盒将1 g RNA逆转录成cDNA,PCR扩增使用1 L cDNA完成,反应条件同前。3.7免疫组化检测小鼠肺组织中 TLR4、MyD88和TRAF6蛋白表达情况小鼠肺组织用4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脱
25、水,二甲苯透明,石蜡切片,脱蜡,抗原修复,分别加入TLR4、MyD88和TRAF6 抗孵育,PBS洗涤3次,滴加相应抗,DAB溶液显色,苏木精复染,脱水,透明,密封,在显微镜下观察肺组织,染色呈棕黄色为阳性,Image-Pro Plus 6.0用于分析图像的信号并计算每个视场的平均吸光度值。3.8 Western blot 法 检 测 小 鼠 肺 组 织 内 TLR4、MyD88和TRAF6蛋白表达情况使用RIPA提取肺组织总蛋白,用 BCA法测定蛋白含量。将 50 g蛋白样本进行SDS-PAGE,电转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉溶液封闭,抗4 孵育过夜,抗37 孵育2 h后使用ECL显影液在
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