lncRNA LINC02381通过miR-133a-3p_MGMT轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响.pdf
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1、 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响陈 静董善武陶 双罗 超陈 玲刘 娜付 阳武汉市第四医院儿科湖北 武汉【摘要】目的:探讨 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺()耐药性的影响 方法:体外培养人脑胶质瘤细胞株、耐 细胞/将/细胞分为/组、组、组、组、组、.组、.组、.组 法检测、/细胞对 的耐药性 检测、水平流式细胞仪检测细胞凋亡双荧光素酶报告实验验证 与 、与 的靶向关系 法检测、蛋白表达 结果:与 细胞相比/细胞中、和 、蛋白表达升高(.)表达降低(.)与/组、组相比 组表达降低(.)表达、细胞凋亡率、和 表达升高(.)与/组、组相比 组、表达降低(.)细胞凋亡率、和 表达升高(.)
2、与、均存在靶向关系、过表达均可逆转 过表达对/细胞 耐药性的影响 结论:沉默可能通过使 表达升高进而抑制 表达降低/细胞对 的耐药性【关键词】脑胶质瘤 【中图分类号】.【文献标识码】:./.【文章编号】()/.【】:()/.:/./.:/(.)(.)./(.)(.)./【收稿日期】【修回日期】【基金项目】湖北省武汉市医学科研项目(编号:)【作者简介】陈静()女湖北人主治医师主要从事实验肿瘤学研究 :.【通信作者】陶双()女湖北人副主任医师主要从事实验肿瘤学研究 :.现代肿瘤医学 年 月 第 卷第 期 .(.)(.)./.:/.【】():脑胶质瘤是常见的大脑恶性肿瘤起源于神经系统胶质细胞约占颅内
3、肿瘤的一半 临床脑胶质瘤的治疗方式多为手术切除联合放化疗可延长患者生存期 替莫唑胺()是脑胶质瘤的标准化疗方案药物之一安全有效临床应用广泛但药物的长期使用会使部分患者发生药物抵抗性无法长期获益 因此明确脑胶质瘤 耐药机制十分必要 长链非编码()已被证实在多种药物的耐药性中发挥作用在多种癌细胞亲本细胞与耐药细胞中存在差异表达 研究显示 在骨肉瘤中表达升高上调 可加速骨肉瘤的发生但其在脑胶质瘤中研究进展较少 可海绵化吸附 促使 难以发挥作用经生信软件分析 与 存在结合位点且 在脑胶质瘤中低表达 研究显示 启动子甲基化可抑制 蛋白表达有利于脑胶质瘤患者预 后 此外生信软件显示 与 存在结合位点 本研
4、究以脑胶质瘤细胞 为研究对象观察 通过 /轴在 细胞抗 药物中的作用并对其机制进行初步探讨 材料和方法.主要试剂与仪器 细胞()、细胞()购自北纳生物公司()购自江西瑞威尔生物 ()、()、()、()、.载体()均 购自百奥迈 科生物 技 术 有 限 公司.()、.()由武汉金开瑞生物工程有限公司合成 培养基()、转染试剂盒()、试剂盒()、海萤荧光素酶辉光检测试剂盒()购自 试剂盒()、蛋白提取试剂盒()、细胞凋亡与坏死检测试剂盒()、()购自上海碧云天兔抗()、()、()、()、()购自山羊抗兔()购自美国 公司培养箱()购自浙江钠德科学仪器有限公司流式细胞仪()购自贝克曼库尔酶标仪()购
5、自美谷分子仪器(上海)有限公司.方法.、/耐药细胞系建立及培养将 细胞在培养瓶()中培养培养基为 培养基 胎牛血清()双链霉素()培养箱条件设置为 、按照常规方法进行传代 对 细胞进行 梯度诱导梯度设置为、/待细胞在最低浓度稳定生长一周后再进行下一个浓度处理至 细胞在/浓度下稳定生长时此时为建立了/细胞系 将/在/下维持耐药性.法检测、/细胞对 的耐药性将、/细胞在 孔板上接种(细胞密度为 个/孔)等细胞贴壁后弃去上清液加入不同浓度的 处理(、.、/)每组 个平行每孔加入适量 溶液()后酶标仪测定吸光度 值按照细胞生存曲线计算细胞半数抑制浓度()实验重复 次.细胞分组收集.节中/细胞将细胞浓度
6、调整至 个/孔在 孔板中接种待融合至 时更换为无血清培养基 通过 转染细胞细胞分组为/组、组、组、组、组、.组、.组、.组.检 测、水平试剂盒提取.、.节中各组细胞总 将一定量 反转录成 并利用 荧光定量检测试剂盒进行 扩增之后进行 预变性 (变性 退火 延伸 )根据 公 式 计 算 相 对 表 达 量、以 为内参 以 为内参 引物序列见表 表 引物序列.()()陈 静等 通过 /轴对脑胶质瘤细胞替莫唑胺抵抗的影响.流式细胞仪检测细胞凋亡收集.节中各组细胞细胞经消化后离心收集加入 室温条件下加入 孵育()再加入 孵育()上流式细胞仪测定各组细胞凋亡比例.双荧光素酶报告实验验证 与 、与 的靶向
7、关系经 网站查找 与 靶向关系经 网站查找 与 关系分别构建 、质粒对其进行定点突变构建 和 质粒将 和 分别与 、共转染至/细胞中通过双荧光素酶报告基因检测各组相对活力 通过 法检测 沉默表达对 以及 过表达对 的影响.法检测、蛋白表达收集.、.节中各组细胞调整浓度(个/孔)加入 孔板经洗涤、重悬细胞后提取细胞总蛋白 试剂盒对总蛋白定量 经 凝胶电泳、转膜、封闭等一系列常规操作后加入()、()、()、()、()一抗稀释液 孵育过夜 洗膜加入二抗()分析蛋白表达水平.统计学方法采用 .统计学软件分析数据计量资料均符合正态分布以均数 标准差()表示组间比较采用独立样本 检验多组间比较采用单因素方
8、差分析进一步两两比较采用 检验.为差异有统计学意义 结果.与 在/细胞中高表达细胞存活率 检测结果显示与 相比干预后/细胞存活率升高(.)且 干预后 /细胞 明显高于 细胞(.)/(.)/提示/细胞对 具有耐药性 结果和 结果显示与 细胞相比/细胞中 和、蛋白表达升高(.)表达降低(.)提示、和 可能参与 细胞对 的耐药性(图)图 与/细胞存活率及、和 蛋白表达水平的比较:、/细胞存活率 :与/细胞中 、表达以及 蛋白表达 与 细胞相比./:/.:/.过表达促进/细胞凋亡 结果显示与/组、组相比 组细胞中 表达升高(.图)提示 过表达细胞转染成功 过表达对/细胞凋亡情况通过流式细胞仪检测结果显
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