Hsa-miR-148a-3p通过下调DUSP1基因促进乳腺癌细胞的恶性行为.pdf
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1、Hsa-Hsa-miR-miR-148148a-a-3 3p p通过下调通过下调DUSPDUSP1 1基因促进乳腺癌细胞的恶性基因促进乳腺癌细胞的恶性行行为为许家铭1,林 龙1,陈琼慧2,李 兰31海南省中医院,海南 海口 570000;2海口市人民医院 肿瘤化疗科,海南 海口 570208;3海南医学院第一附属医院,海南 海口 570102Hsa-miR-148a-3p promotes malignant behavior of breast cancer cells by downregulatingDUSP1XU Jiaming1,LIN Long1,CHEN Qionghui2,LI
2、 Lan31Hainan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Haikou 570000,China;2Department of Cancer Chemotherapy,Haikou PeoplesHospital,Haikou 570208,China;3First Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570102,China摘要:目的 通过生信分析结合体内外实验验证Hsa-miR-148a-3p调控双特异性磷酸酶1(DUSP1)对乳腺癌细胞生物学行为的
3、影响。方法 TCGA数据库下载数据并鉴定差异微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA);数据库筛选差异miRNA靶基因;String和Cytoscape构建蛋白质互作网络及筛选TOP10 hub基因;TCGA数据库验证TOP10hub基因的表达;Cytoscape构建miRNA-TOP10hub基因网络。定量逆转录 PCR(RT-qPCR)实验检测Hsa-miR-148a-3p和DUSP1在人乳腺癌组织和细胞中的表达。采用Hsa-miR-148a-3p mimic、Hsa-miR-148a-3p inhibitor及对照NC转染MCF-7细胞。分为NC组,NC mimics组,Hsa-m
4、iR-148a-3p mimics组,NC inhibitor组,Hsa-miR-148a-3p inhibitor组;荧光素酶报告基因实验验证Hsa-miR-148a-3p和DUSP1的结合;CCK-8,划痕实验,Transwell和细胞凋亡实验验证Hsa-miR-148a-3p对乳腺癌细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡的影响。建立裸鼠成瘤模型,测量小鼠肿瘤质量和体积;Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠生存情况;免疫组化检测DUSP1的表达水平。结果 获得乳腺癌差异miRNA54个(8个下调,46个上调),差异mRNA799个(509个下调,290个上调);54个差异miRNA预测靶基因371
5、6个,与差异mRNA取交集,得到150个交集基因;蛋白-蛋白互作网络图中的TOP10hub基因为MET,LPAR1,LAMC1,FOS,EGFR,PIK3R1,DUSP1,GNAI1,LAMA4,NR3C1,这些基因在乳腺癌组织中均显著下调;双荧光素酶报告基因实验证实Hsa-miR-148a-3p能与DUSP1结合;RT-qPCR结果表明,Hsa-miR-148a-3p在乳腺癌组织和细胞中显著上调(P0.01),而DUSP1则显著下调(P0.01)。细胞实验结果表明,Hsa-miR-148a-3p促进乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭,抑制细胞的凋亡(P0.01)。动物实验结果表明,Hsa-miR-1
6、48a-3p促进小鼠体内肿瘤质量和体积的增长(P0.01),缩短小鼠的存活时间(P0.01),免疫组化结果显示,Hsa-miR-148a-3p 抑制DUSP1的表达水平(P0.01)。结论 Hsa-miR-148a-3p通过抑制DUSP1的表达而作为癌基因发挥作用,这有助于开发针对乳腺癌的新型治疗靶点。关键词:Hsa-miR-148a-3p;DUSP1;乳腺癌;促癌Abstract:Objective To investigate the role of Hsa-miR-148a-3p in regulating biological behaviors of breast cancer ce
7、lls andexplore the mechanism.Methods TCGA database was used to identify the differential miRNAs and mRNAs in breast cancer,and the protein-protein interaction(PPI)network was constructed using String and Cytoscape to screen the top 10 hub genesand construct the miRNA-TOP10hub network.RT-qPCR was use
8、d to detect the expressions of Hsa-miR-148a-3p and DUSP1 inbreast cancer tissues and cell lines.The effects of Hsa-miR-148a-3p mimic and inhibitor on proliferation,migration,invasionand apoptosis of MCF-7 cells were analyzed,and luciferase reporter gene experiment was performed to verify the binding
9、 ofHsa-miR-148a-3p to DUSP1.The effect of Hsa-miR-148a-3p overexpression on breast cancer cell xenograft growth wasevaluated in nude mice.Kaplan-Meier survival curve analysis was used to analyze the survival of the tumor-bearing mice,andthe expression level of DUSP1 in the xenografts was detected us
10、ing immunohistochemistry.Results A total of 54 differentialmiRNAs and 799 differential mRNAs were identified in breast cancer;3716 target genes were intersected with the differentialmRNA,resulting in 150 intersected genes.The top 10 hub genes were downregulated in breast cancer tissues in the PPInet
11、work.Double luciferase reporter gene experiment confirmed that Hsa-miR-148a-3p was capable of binding to DUSP1.Hsa-miR-148a-3p was up-regulated and DUSP1 was down-regulated significantly in breast cancer tissues and cells(P0.01).Inbreast cancer cells,Hsa-miR-148a-3p mimic strongly promoted cell prol
12、iferation,migration and invasion and inhibited cellapoptosis(P0.01).Hsa-miR-148a-3p overexpression obviously promoted xenograft growth in nude mice(P0.01),shortenedsurvival time of the mice(P0.01),and reduced the expression of DUSP1 in the xenografts(P0.01).ConclusionHsa-miR-148a-3p promotes maligna
13、nt behavior of breast cancer cells by inhibiting the expression of DUSP1.Keywords:Hsa-miR-148a-3p;DUSP1;breast cancer;tumor promotion乳腺癌是全世界最常见的肿瘤之一(11.7%),甚至超过了肺癌(11.4%)1。其发病率逐年增加,且发病年龄逐渐年轻化。目前,已经成为威胁女性健康的第一杀手。乳腺癌的发生是一个由多种基因和多种因素引起收稿日期:2023-01-06基金项目:海南省自然科学基金高层次人才项目基金(821RC719)作者简介:许家铭,主治医师,E-mail
14、:通信作者:林 龙,主任医师,E-mail:J South Med Univ,2023,43(9):1515-1524doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.09.091515的复杂生物学过程。随着分子生物学的发展,通过对乳腺癌基因表达谱的分析发现,不同的基因表达与乳腺癌的各种生物学行为有关 2。因此,肿瘤基因谱的研究有助于肿瘤的诊断和治疗以及预后的判断。微小RNA(miRNA)通过与mRNA的3非翻译区(3UTR)的序列特异性碱基配对来抑制基因表达,导致其翻译抑制或降解。有证据表明,miRNA可通过控制癌细胞中不同的细胞和代谢途径来调节基因表达,进而作为抑癌基因
15、或致癌基因,因此其可能成为多种癌症的有前途的生物标志物 3,4。先前的研究提示,Hsa-miR-148a-3p在乳腺癌 5,胃癌 6,卵巢癌 7 中均有研究,提示其在癌症中可能是一个相对重要的miRNA,然而,关于其在乳腺癌中的研究较少,且尚未有研究关注其下游目标。本研究从生信分析出发,进行一系列数据库分析,确定了与乳腺癌相关的miRNA,即Hsa-miR-148a-3p,关于其对乳腺癌细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡的影响进行了更具体的研究,且研究确定了其靶向的基因双特异性磷酸酶1(DUSP1),提出了一个新的信号轴,这或许可以为人类乳腺癌的治疗提供新的靶点和机制。1 材料和方法1.1 数据收集及
16、分析使用 The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库(https:/www.facs.org/quality-programs/cancer/ncdb)获取乳腺癌组织样本和癌旁组织样本的差异表达的miRNA和mRNA数据,使用R语言包对获取的数据进行分析,筛选差异基因的标准为:|log2 Fold change|2同时p-value0.01。1.2 差异miRNA靶基因的预测及mRNA的确定使 用 miRTarBase(http:/mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)TargetScan(http:/www.targetsca
17、n.org/)和 ENCORI(https:/ mRNA蛋白质-蛋白质互作分析及top10 Hub基因的筛选使用 String 数据库联合 Cytoscape3.7.1 软件将mRNA的蛋白质-蛋白质互作分析网络图进行可视化,利用 Cytoscape3.7.1 软件的 cytohHubba 插件筛选top10Hub基因。1.4 miRNA-TOP10hub基因网络图的构建及TOP10hub基因表达水平的验证使 用 Cytoscape3.7.1 软 件 将 miRNA 数 据 和TOP10hub基因数据导入软件,绘制miRNA-TOP10hub基因网络图。使用TCGA数据库的数据绘制TOP10h
18、ub基因表达水平的箱线图。1.5 实验验证1.5.1 组织样本 收集2019年1月2021年2月海南省中医院采集经病理学诊断证实的人乳腺癌和癌旁组织样本各30例。所有患者均签署知情同意书,所有组织标本均在手术切除时采集,然后立即在液氮中冷冻并储存在-80 中备用。实验经海南省中医院伦理委员会批准。1.5.2 细胞培养和细胞转染 正常乳腺上皮MCF10A细胞和人乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231细胞从中国科学院上海细胞生物学研究所获得,并在37、5%CO2的湿润环境中培养。人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231在Roswell Park Memorial Institute RPMI
19、 1640培养基(Invitrogen)中培养,补充10%FBS和1%青霉素-链霉素。MCF10A细胞在含有5%马血清(HS,Invitrogen)、0.5 g/mL 氢化可的松(Sigma)、10 g/mL 胰岛素(Sigma)、0.02 g/mLEGF(Pepro Tech)、0.1 g/mL霍乱毒素(Sigma)和青霉素-链霉素的DMEM-F12(Invitrogn)中培养。Hsa-miR-148a-3p mimics,NC mimics,Hsa-miR-148a-3p inhibitor,NC inhibitor由RiboBio(中国广州)构建。所有细胞系以5105/孔的密度在6孔板中
20、培养,并孵育过夜。使用 LipofectamineTM2000 试剂(Invitrogen)进行转染,并在37、5%CO2的潮湿条件下再孵育48h。1.5.3 定量逆转录 PCR(RT-qPCR)根据制造商的说明,使用TRIzol(TaKaRa)从细胞中提取总RNA。使用PrimeScript RTmaster mix(TaKaRa)或miScript逆转录试剂盒(Qiagen)进行 mRNA 或 miRNA 的逆转录(RT)。使用特异性引物进行扩增。SYBR Green定量PCR反应在20 L反应体积,含有2PCR Master Mix(Applied Biosystems)。使用2-CT方
21、法对每个样本的基因表达进行相对定量。每个实验一式三份。引物序列如下:hsa-miR-148a-3p:上游引物:5-TCAGTGCACTACAGAACTTTGT-3;下游引物:5-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3;DUSP1:上游引物:5-AGAGCCCCATTACGACCTCT-3;下游引物:5-CCAGAGGAACTCGGGTGAAG-3;U6:上游引物:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3;下游引物:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3;GAPDH:上游引物:5-TCATGACCACAGTCCATGCC-3;下游引物:5-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-
22、3。1.5.4 荧光素酶报告活性测定 将DUSP1 3UTR的野生型和突变型Hsa-miR-148a-3p结合序列克隆到pGL3Basic载体中(Promeg)。Hsa-miR-148a-3p和DUSP1重组质粒的3UTR(WT或MUT)共转染293T细胞。使用LipofectaminTM2000试剂(Invitrogen)进行转染,并使J South Med Univ,2023,43(9):1515-1524http:/www.j-1516用双荧光素酶报告检测系统(Promega)检测荧光素素酶活性。1.5.5 CCK-8实验 将细胞密度调整为20 000/mL,用CCK-8试剂盒(MCE)
23、检测细胞增殖。细胞转染后,在培养24、48和72 h后,向每个孔中加入10 g CCK8溶液。用微量板读数器在450 nm的吸光度下测量光密度值。1.5.6 划痕实验 将细胞置于六个孔板中,每孔含有3.5105个细胞和2 mL完整培养基。培养细胞直至达到95%汇合。然后,使用20 L移液管尖端在每个孔中创建垂直伤口,并将不含FBS的培养基添加到每个孔中。在0和48 h用光学显微镜(Axio Lab.A1 pol)收集每个孔的图像。ImageJ软件1.8.0(National Institutesof Health)用于分析图像。1.5.7 Transwell 实验 通过用50 mLMatrig
24、el(BD Bio-sciences)涂覆腔室来评估细胞侵袭。将100 mL无血清培养基中的1105个细胞置于涂有Matrigel的上室中。将含有10%FBS的500 mL完整培养基置于下部室中。将侵袭到下腔室的细胞固定在4%多聚甲醛中,并在室温下用0.1%结晶紫染色15 min,然后在倒置相差显微镜(Olympus)下选至少3个随机视野计数。1.5.8 流式细胞术 使用Annexin V/PI试剂盒(KeyGenBiotech)通过流式细胞术检测细胞的凋亡。简而言之,转染后,将细胞置于六个孔板中,每孔含有2.0105个细胞和2 mL完整培养基。再孵育24 h后,收集细胞并在黑暗中与Annex
25、inV孵育15 min。然后,将细胞与PI在黑 暗 中 孵 育 25 min。并 通 过 流 式 细 胞 仪(BDBiosciences)计算细胞凋亡率。1.5.9 动物实验 5周龄雄性BALB/c裸鼠39只,饲养在25 的无菌条件下。将稳定转染Hsa-miR-148a-3pmimics、Hsa-miR-148a-3p inhibitor 的 MCF-7 细 胞(100 LPBS中含1107个细胞)皮下注射裸鼠的左侧区域。每组3只小鼠用于测量肿瘤体积和质量。6周后,通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死,并称取肿瘤组织的质量和计算肿瘤体积。通过游标卡尺测量肿瘤的长度(L)和宽度(W)并使用以下公式来计算
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