MS方法全景式破译灵芝孢子粉中酚性杂萜成分.pdf
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1、512nSuu品种品质Pharmacy andChineseMateriaMedica2023;14(4)ttnllcs中药与临床MS方法全景式破译灵芝孢子粉中酚性杂成分黄丽娜,MadhuBabu Sura,刘云云,程永现摘要 目的:灵芝孢子粉市场产品多,但有效成分知之少,探索其是否含有子实体中的杂结构类型及其特征。方法:SephadexLH-20过滤法富集总杂菇并聚类,HPLC-Q-TOF-MS/MS技术通过采集化合物的质荷比并结合二级碎片离子信息和化合物质谱裂解规律,与自建灵芝芳香杂数据库比对推测化合物可能的结构。结果:发现与数据库有关联匹配的化合物6 2 9个,其中相似度在8 0%以上的
2、且扣除不重复的有93个。结论:首次全景式破译灵芝孢子粉中的杂数量和结构类型,为其相关的产品质控、网络药理学研究或新药发现提供了宝贵材料。关键词】灵芝/赤芝;孢子粉;杂;液相一质谱联用;数据库中图分类号 R282文献标识码 A文章编号】16 7 4-92 6 X(2023)04-002-010Demystifying phenolic meroterpenoids in Ganoderma lucidum spores by LC-MS/MS analysis/HUANG Li-na,Madhu Batra,LIU Yun-yun,CHENG Yong-xian/(School of Pharm
3、aceutical Sciences,Health Science Center,Shenzhen University,Shenzhe8060.Guangdong)Abstract Objective:The utilization of Ganoderma lucidum spores in various commercial products is widespread.Whilemeroterpenoids have been found in the fruiting bodies of Ganoderma,their presence in the spores remains
4、largely unknown.Thisstudy aims to elucidate the profiling of meroterpenoids in Ganoderma spores.Method:Sephadex LH-20 filtration method wasused to concentrate total meroterpenoids and cluster them.HPLC-Q-TOF-MS/MS technique collected the mass charge ratio of thecompounds,combined with the secondary
5、fragment ion information and the cracking rule of the combined mass spectrum,andcompared with the self-established Ganoderma lucidum aromatic meroterpenoidsdatabase to predict the possible structure of thecompounds.Result:The results revealed that the MS/MS fingerprints of 629 peaks exhibited varyin
6、g degrees of matching with thestructures in the database,while 93 peaks showed more than 80%similarity with the experimental data in the database.Conclusion:This study provides the first insight into the numbers and structural types of meroterpenoids present in Ganoderma lucidum spores.These finding
7、s will contribute to quality control,network pharmacology,and the development of new drugs derived from Ganodermalucidum.Key words Ganoderma lucidum;spores;meroterpenoids;LC-MS/MS;self-established database灵芝,又称灵芝草、菌灵芝、木灵芝,为灵芝科灵芝属真菌的子实体,是中国九大仙草之一,具有补气安神,止咳平喘功效,在我国作为传统中药使用已有2 0 0 0 多年历史。现代研究表明灵芝富含多基金项
8、目 国家自然科学基金重点项目“药典中药药效物质再认识:灵芝抗三阴性乳腺癌的杂枯结构、药理效应与作用机制研究”(No.82030115);深圳市科技计划基础研究(重点项目)“抗肾脏纤维化新型真菌类中药研发和作用机制研究”(No.JCYJ20200109113803838)作者单位 深圳大学医学部药学院,广东深圳518 0 6 0作者简介 黄丽娜(1997-),女,在读硕士研究生,主要从事中药化学方向研究Tel:18804309490Email:通讯作者 程永现(197 2-),男,博士,主要从事中药化学方向研究Email:收稿日期 2 0 2 3-0 5-0 3种次生代谢产物,报道的成分有多糖和
9、三类,但灵芝杂鲜有报道。作者所在课题组致力于灵芝子实体研究14年之久,尤其在灵芝杂新结构类型化合物深入挖掘方面取得重要进展,分离鉴定的化合物数量多达近七百个。为了对杂进一步研究发挥指导作用,作者用高效液相色谱串联质谱分析技术(H PL C-Q-T O F-M S/M S)对可及的灵芝杂进行了人库管理,在高分辨质谱自建数据库的基础上,采用HPLC-Q-TOF-MS/MS分析了灵芝孢子粉的杂粘成分,以试图了解孢子粉中杂的分布及其特征。通过采集样品的质荷比信息,结合二级碎片离子信息和化合物质谱裂解规律,与数据库进行比对,进而推测化合物可能的结构来进行定性分析,得出了赤芝孢子粉的杂全谱信息,这将为灵芝
10、孢子粉的深度开发利用提供基础-4。Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)中药与临床1材料与方法1.1试剂与仪器灵芝孢子粉产地为广东省韶关市始兴县隘子镇,样本由云南中医药大学邱斌教授鉴定为灵芝(Ganodermalucidum)孢子粉,凭证标本保存于深圳大学医学部药学院;LC/MS级乙腈,A011968,安耐吉化学;LC/MS级甲酸,WJ338183,购自赛默飞世尔科技公司;纯化水,购自香港屈臣氏集团有限公司;B8A224S型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司),SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股
11、份有限公司),AglientHPLCEC-C18色谱柱;SCIEXX500QTOF质谱仪。SephadexLH-20(25-100 um,Amersham Pharmacia Biotech)1.2样品的制备1kg破壁灵芝孢子粉在室温下用6 倍体积95%乙醇(6 L)超声提取30 min,温度45,提取一次,提取液减压浓缩得粗提物3.15g,经SephadexLH-20柱,甲醇洗脱,薄层色谱检测,合并得6 个组分。每个组分取10 mg样品,加人1mL甲醇超声溶解,离心取上清液供质谱检测使用。1.3高液相色谱条件色谱柱AglientHPLC EC-C18色谱柱(2.7 m4.6mm100mm),
12、流动相由0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)组成,梯度洗脱:0 min,90%A;99 min,30%A;106 min,0%A;113 min,0%A;113.0 1m i n,90%A;12 0 m i n,0%A,进样体积为 5 L,流速为0.3 mLminl。1.4质谱条件质谱系统采用SCIEXX500QTOF质谱仪,采用IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中,筛选出强度大于50 的离子进行对应的二级质谱数据采集。具体质谱参数如下:解簇电压DP:80eV;一级轰击能量:10 eV;二级轰击能量CE:35eV,碰撞能差CES:15V;雾化气压(GS1):55P
13、si,辅助气压:55Psi,气帘气压:35Psi,温度:550,喷雾电压:550 0 V(正离子模式)1.5化合物的鉴定采集得到的数据(IDA模式下的MS和MS/MS数据)导人SCIEXOSLibrary软件,选择相应加荷形式(PO S:+H、+K、+Na、+L i 等),时间范围设定为0-120min,分子质量偏差和碎片质量偏差分别设置为10 ppm,以质量数和质谱数据进行峰匹配、峰提取,得到包含每个保留时间和质量数对应的峰强度的矩阵数据。然后,利用二级质谱数据库(SCIEXOSLibrary)对采集到的MS/MS数据的进行对比,进而得出匹配的化合物的结构、分子式。2结果通过上述分析方法,对
14、富集的6 个组分中的总杂进行检测对比,共检测出6 2 9个化合物(这里仅显示相似度达到8 0%以上的结构信息),其中与自检的灵芝杂数据库匹配度达到8 0%以上的有113个,扣除重复的且非杂成分还有93个,占所有化合物的约18%,从HPLC-Q-TOF-MS/MS分析获得的包括分子量和MS/MS等数据,如表2-7 所示。可看出质谱碎片匹配度达到8 0%以上的结构大多为灵芝杂,但也有假阳性结果。表1HPLC-Q-TOF-MS/MS分析鉴定的灵芝孢子粉提取物匹配的化合物相似度组分80%-100%60%-80%40%-60%0%-40%总计组分1247122669组分217142268121组分324
15、2120129194组分421131565114组分5125164073组分6157132358总计113679835162944.84440616.64730660.03738.32263.31470.69520830.11059.11514.99417.34748.87676.85063.90892.33699.25146.4151e6179.17489.450496.875101.7823.61214.21023.5362巷.58 184.413106.634.117.572eo10203040506078090100110图1组分1在正离子模式下总离子流图3.00693.42.98.7
16、0254.24361.42088.0832.50638.73949.68005.068101.98180.28478.10867.2372.00616.669102.83763.06370.39917-34831.91433.3331.50670.420103.84628.8241.0e63.89517.991103:20215.0153.526117.5616.005104.9835.2820.0001102030405060708090100110图2 组分2 在正离子模式下总离子流图46.1491.00617.82768.2269.00567.430100,1698.00589.1431
17、7.1147.00515,30731.93293.234102.8218.0562.70976.30481.39393.3606.00514.646101.85942.3374.00539.98348.71056.85362-24080.91692.805102.8103.747.5.16075.8303.00582.67793.819103.46228.13239:25482.4002.006405.10211.63814.28316.00310050.0e0A102030405060708090100110Tima,mils图3组分3在正离子模式下总离子流图50647.48843.8754
18、.0703068.16818-27828,665117,20720632.75710.50935.73042.402 62-87756.46856.48467.91882.08794.72309.39710624.13972.51575.70309.51899.861105.177113.3291020394050708090100110图4组分4在正离子模式下总离子流图8PharmacyChineseMateriaMedica2023;14(4)danc中药与临床27.78730.3402.00616.0881.5e628.20252.47527.03429.54558.03650.7641
19、.00660.63169.4713.84729.69437.14013.85766.33970.01134.41846.01576.9045.0e523.81430.40885.953115.8267.83787:0540.0e0102030405060708090100110图5组分5在正离子模式下总离子流图16.5882.0061.50067.40615.76566.01667,52958.981100.8141.00615.01446.84951.57158.10972.08940.25364.35940.57774.46182.97390.1195.0057.88414.14317.3
20、1324.04139.61590342101.02789.239115.75737.06444.2127.45529.39898.280人0.0e010203040506070901004110图6 组分6 在正离子模式下总离子流图0.000L1020304050607080901001100.00L102030405060708090100110图5组分5在正离子模式下总离子流图图6 组分6 在正离子模式下总离子流图表2 组分1采用HPLC-Q-TOF-MS/MS化学成分分析RNeutral mass Found massNo.MolecularformulaQuasi-moleculari
21、onDatabase scoreIdentificationUV/DAD spectrum(min)(Da)(Da)1C2,H240s4.30M+Na*379.1974379.1973100%Aanoleucin cl52Ci6H200711.09M+Na*347.2068347.2068100%Applanatumol R(6j3CisHi:O,9.08M+Na333.1912333.1912100%UP*4Ci6H2 074.78M+Na*349.1861349.1863100%UP*5Ci,H220,14.21M+Na*361.2225361.222598.5%Applanatumol
22、Qla)6CioHi.O655.70M+H305.1115305.111598.0%Applanatumol olal7CiH2oO;24.37M+Na315.1802315.180297.6%Gancochlearol Fl78C2,H2:O,25.56M+Na447.2963447.296497.2%UP*9C2,H2.0。106.89M+Na*397.3316397.331695.1%Ganotheaecolumol A(8)10C2H2:O7101.09M+Na427.3424427.342293.3%Amaurosubresin911C2,H2:O.84.37M+Na*399.310
23、7399.310793.1%UP*12C20H2.O,93.47M+Na*369.2998369.299692.9%UP*13C2H30O772.43M+Na*429.3214429.321692.1%UP*14C2,H30O,106.84M+Na441.3581441.35889.1%UP*15C2,H2.O,115.90M+Na*381.3363381.336488.8%Zizhine A lo)16C2,H2.O793.07M+Na*413.3262413.326188.8%Ganocalidin Bl5Pharmacy andChineseMateria Medica2023;14(4
24、)中药与临床17C42Hs40777.47M+Na*693.3810693.381285.6%UP*18Ci4Hi4O,35.08M+Na285.2919285.291885.6%Applanatumol yl6)19C2sH30O,92.09M+Na*501.3791501.379184.7%Cochlearoid Hl!20Ci,Hi:O76.31M+Na341.2683341.268284.6%Spiroapplanatumine-pl1221C2H2.O57.88M+Na489.3435489.343484.1%Curcoligoside I113)122C.,H2:O;101.35M
25、+Na383.3157383.315983.5%Gancochlearol L1423Ci,H220s62.35M+Na353.3550353.354981.7%UP*24CisH220658.92M+Na357.2634357.263680.2%UP*UP:unpublishedStructures other than meroterpenoid.表3组分2 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS化学成分分析MolecularRNeutral massFound massDatabaseNo.Quasi-molecularionIdentificationUV/DAD spectrumfor
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