Clk1基因对Aβ诱导的阿尔茨海默病自噬水平的影响.pdf
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1、网络出版时间:网络出版地址:基因对 诱导的阿尔茨海默病自噬水平的影响司文英,孟宪勇,孙晓静,侯宇清,董晓华(河北北方学院 药学院,河北省神经药理学重点实验室,附属第一医院,河北 张家口 )收稿日期:,修回日期:基金项目:河北省自然科学基金资助项目();河北省卫生厅资助项目();河北北方学院自然科学研究计划项目()作者简介:司文英(),女,硕士生,研究方向:神经精神药理学,:;董晓华(),女,博士,教授,硕士生导师,研究方向:神经精神药理学,通信作者,:文献标志码:文章编号:()中国图书分类号:;摘要:目的探讨 转染沉默 基因对阿尔茨海默病(,)模型细胞自噬水平的影响。方法采用 法及 转染沉默
2、基因技术,观察 、基因对细胞存活率的影响。细胞免疫荧光观察自噬标志物微管相关蛋白 轻链 (,)表达情况。检测 、自噬相关蛋白 、表达情况。实时荧光定量聚合酶链式反应()检测 、水平的变化。结果与 组相比,组 细胞的活力明显降低(),而沉默 后 组细胞活力较 组明显升高()。细胞免疫荧光结果显示 组 表达较 组明显升高(),组 表达较 组明显降低()。结果显示与 组相比,组 、蛋白表达明显增加(),、蛋白表达明显降低();与 组相比,组 、蛋白表达明显降低(),、蛋白表达明显增加();加入 和 可以逆转沉默 对 、蛋白的影响。结果显示 组与 组相比,、水平无差异(),其余各组间比较 、与蛋白水平
3、变化一致。结论沉默 表达可以缓解 诱导的 细胞过度自噬引发的细胞存活率降低,其机制可能与 信号通路及 相关。关键词:;阿尔茨海默病;淀粉样蛋白;自噬;开放科学(资源服务)标识码():阿尔茨海默病(,),又称老年痴呆,是一种进行性神经退行性疾病,淀粉样蛋白(,)沉积是 的主要病理变化之一 。自噬在 发生发展过程中是一把双刃剑,研究表明,在 发病早期,激活自噬及时清除错误折叠的蛋白及受损细胞器,可以减少 造成的神经元的损害;但随着 病程的发展,神经元内异常蛋白逐渐增加,诱发病理性过度自噬导致大量自噬小体的聚集,造成神经元损害,因此,维持细胞自噬稳态,抑制过度自噬可能在 发病过程中发挥重要作用 。最
4、早在线虫中发现,是一种与长寿相关的基因。已被证实与衰老、流感病毒、药物成瘾、肿瘤、帕金森病等相关疾病有关。氯碘羟喹作为一种金属螯合剂,可以抑制哺乳动物细胞中 的活性,从而改 善 模 型 小 鼠 的 症 状 及 患 者 的 临 床 表现 ,前期实验结果显示 小鼠空间学习记忆能力较野生型小鼠增强,同时侧脑室注射 的 模型 小鼠也较野生型模型小鼠学习记忆能力增强,但具体机制尚不清楚。文献报道 基因与细胞自噬水平密切相关 ,因此,本实验将从自噬角度探究 基因缺失改善 认知功能障碍的可能机制。材料与方法 细胞株小鼠海马神经元细胞系 细胞(苏州大学神经精神疾病研究所赠予)。药物与试剂 高糖培养基(,批号:
5、);四季青无噬菌体低内毒素特级胎牛血清(浙江天杭科技公司,批号:);(北京博奥森生物技术有限公司,批号:);(上海吉玛制药技术有限公司);(;批号:);(;批号:);(;批号:);中国药理学通报 ;():(华安生物;批号:);(;批号:)、(;批号:)。仪器二氧化碳培养箱(公司);体视学显微镜(公司);多功能酶标仪(公司);超速冷冻离心机(公司);聚合酶链反应()仪、蛋白电泳仪、湿转仪(美国 公司);多色荧光和化学发光成像系统(公司);共聚焦激光扫描显微镜(公司)。方法 细胞培养 细胞在 高糖培养基、胎牛血清和 青霉素 链霉素的混合物中培养,细胞融合度达 时进行传代。观察 转染效率以及 、蛋白
6、表达情况转染前 ,将 细胞以每孔 的密度种 孔板,当细胞生长密度达 时,按照说明书将 与 转染试剂形成浓度为 的转染复合物,转染 后 检测 、蛋白表达情况。法检测不同浓度 对 细胞活力的影响将 溶解于超纯水中,使其终浓度为 ,过 滤膜,使用前 孵育 达到“老化”状态。将“老化”的 稀释成不同浓度(、)后,与 细胞共孵育 建立 模型。应用 法检测不同浓度下 细胞的存活率,确定 损伤的最佳浓度。检测各组细胞存活率细胞分为 组、组、组、组,将 细胞种到 孔板中,贴壁生长后各组细胞分别加入各试剂于 、培养箱孵育,后每孔加 溶液,避光孵育 后更换 ,于多功能酶标仪检测各孔吸光度值,根据细胞存活率(实验组
7、 值 空白组 值)(对照组 值 空白组 值),计算出各组细胞存活率。细胞免疫荧光染色将 细胞以每孔 的密度种激光共聚焦小皿,分组培养 ,弃去培养基;用 多聚甲醛固定 ,清洗 次,每次 ;透化液处理细胞 ,清洗 次,每次 ;牛血清白蛋白室温封闭 ,加入一抗微管相关蛋白 轻链(,)()过夜,加入 标记的二抗(),避光孵育 ;染色液对细胞核进行复染,激光共聚焦显微镜下观察,拍照采集图像,使用 软件对荧光强度进行分析。检测蛋白含量各组细胞培养 后提取总蛋白,超声辅助破碎细胞,离心后取上清液,法测定蛋白浓度,恒温金属浴变性。取 蛋白样品,凝胶电泳分离蛋白,湿转仪转膜,脱脂奶粉封闭。加入一抗 ()、()、
8、()、()、()、()、()、()、()、()、(),孵育过夜,洗膜 次,每次 。加入二抗(标记山羊抗兔 ;标记山羊抗鼠 )室温孵育,洗膜次,每次 。曝光显影,图像扫描后用 软件进行灰度值分析,实验重复 次。实时荧光定量聚合酶链式反应()检测自噬相关因子 表达将 细胞以每孔 的密度种 孔板,分组培养 后,提取总 。超微量紫外分光光度计检测 浓度和纯度;,;,进行反转录得到 ,然后进行 实验,条件:;,;每个基因设个复孔,各复孔差值小于 ,实验结果采用 法分析数据。基因引物序列见 。:统计学分析所有实验数据采用 软件和 软件进行统计分析和绘图,数据以珋 表示,两组间比较使用独立样本 检验,多组间
9、比较使用 。结果 法检测不同浓度 对 细胞活力的影响 结果显示(),不同浓度 中国药理学通报 ;()(、)与 细胞共孵育 均可降低细胞的活力,且 浓度越高,细胞活力越低,的 作用 细胞 ,细胞活力明显降低,约为 ,与对照组相比差异有统计学意义(),因此,使用 的 用于后续实验。(珋 ,),沉默 基因对 处理后细胞活力的影响各组细胞活力结果显示(),与 组相比,组细胞活力明显降低();组细胞活力与 组相比未见差异(),而 组细胞活力与 组相比明显升高()。表明沉默 基因无细胞毒性,并且可缓解 引起的细胞损伤。(珋 ,);沉默 对细胞内 、蛋白含量的影响 转染沉默 基因后,结果表明(),与 组相比
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