转基因棉花再生植株育性影响因素研究.pdf
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1、棉花是重要的经济作物袁在经济发展中占有重要地位遥 因此利用生物技术改良棉花品种具有重要的意义遥 利用转基因技术对棉花进行遗传改良是一种高效的分子育种手段袁转基因不仅能够拓宽可利用的基因资源袁也为棉花功能基因的验证和应用提供有效的技术支撑1遥 将调控农艺性收稿日期院 2021-05-13第一作者简介院罗晓丽渊1963冤袁女袁研究员袁遥*通信作者院基金项目院国家自然基金渊31971905冤曰运城市农业科学合作研究院农业科技攻关项目渊2021YNGG09冤转基因棉花再生植株育性影响因素研究罗晓丽1袁肖娟丽1袁王志安1袁刘圆1袁张安红1袁吴家和2*渊1.山西农业大学棉花研究所/棉花种质资源利用与分子生
2、物学设计育种山西省重点实验室袁山西 运城 044000曰2.中国科学院微生物研究所/植物基因组学国家重点实验室袁北京 100101冤摘要院揖目的铱探究影响农杆菌介导棉花体细胞转化体系产生的再生植株育性的影响因素遥 揖方法铱从载体大小尧目的基因大小尧不同阶段组织培养时间等因素对 6 个载体的转基因再生植株当代渊T0冤育性影响进行分析遥 揖结果铱不同载体/目的基因的转基因植株不育率呈现显著差异袁但是转基因植株育性与载体大小尧目的基因大小之间没有明显关系遥 进一步研究发现转基因再生植株不育率与胚性愈伤组织分化-植株再生的培养时间呈显著正相关袁分化-植株再生培养时间少于 110 d尧110130 d尧
3、130150 d尧150170 d尧超过 170 d 的植株不育率分别为 19.6%尧45.5%尧63.8%尧72.3%尧94.5%曰而与诱导愈伤组织形成-胚性愈伤组织分化的持续培养时间没有相关性遥 揖结论铱转基因棉花再生植株育性受到胚性愈伤组织持续培养时间的显著影响袁缩短胚性愈伤组织到植株再生的培养时间能够提高转基因再生植株的育性遥关键词院棉花曰转基因再生植株曰胚性愈伤组织曰分化曰植株再生曰培养时间曰不育率Luo Xiaoli1,Xiao Juanli1,Wang Zhian1,Liu Yuan1,Zhang Anhong1,Wu Jiahe2*(1.0440002.)Objective T
4、his study aims to explore factors affecting the fertility of cotton transgenic regenerated plants producedby-mediated transformation system via somatic cell embryogenesis.Method In this study,several factors,including vector size,transgene insertion size,and different duration of culturing period we
5、re analyzed for evaluating theireffects on the fertility of regenerated transgenic plants(T0generation).Result There were significant differences in sterilityrate among transgenic plants of 6 different transgene and expression vector size.But there was no obvious correlation betweensterility rate an
6、d vector/insertion size.Further analysis showed that the sterility of regenerated transgenic cotton plant hadsignificantly positive correlation with the duration of embryogenic callus differentiation to plantlet regeneration.The sterility rateof regenerated plants from the duration of embryogenic ca
7、llus differentiation to plantlet regeneration of 170 d were 19.6%,45.5%,63.8%,72.3%,and 94.5%,respectively.However,transgenic cottonplant sterility was not correlated with the duration of callus induction to callus embryogenesis.Conclusion Through-mediated cotton genetic transformation,the sterility
8、 of cotton regenerated plants was mainly affected by theduration of embryogenic callus differentiation to plantlet regeneration,and accelerating the procedure of embryogenic callusdifferentiation could increase the fertility of regenerated transgenic plants.cotton;transgenic regenerated plant;embryo
9、genic callus;embryogenic callus differentiation;plantlet regeneration;culturing duration;sterility rate棉 花 学 报Cotton Science2023袁35渊3冤院230238https:/doi.org/10.11963/cs202100323 期状的关键基因转化到棉花中袁提高其产量尧品质和抗逆性袁将其它外源基因转入到棉花中增加植株的抗虫性尧抗除草剂特性袁可以在提高棉花生产效率的同时减轻环境污染2遥 例如袁转抗虫棉20多年的广泛种植袁 对棉花生产效率的提高作出了巨大贡献袁 并且减少了杀虫
10、剂的使用袁利于保护环境3遥目前棉花遗传转化最主要的方法为农杆菌介导的转基因技术袁常规流程是用农杆菌菌液浸染棉花下胚轴切段并共培养后袁将转化的下胚轴外植体进行愈伤组织诱导和筛选培养袁再将诱导出的抗性愈伤组织进行增殖培养和分化培养以获得转基因再生植株袁随后在温室或网室嫁接再生植株袁生长直至收获种子遥 农杆菌介导的棉花转基因体系是以体细胞再生为基础袁需要进行较长时间的组织培养遥 在棉花体细胞胚发生和植株再生过程中常伴随着大量的畸形胚和苗袁转基因棉花材料具有不稳定性袁 尤其是T0代转化植株存在大量的不育株袁有些占比高达80%以上4-5遥张家明等6研究得出体细胞培养获得的再生植株中存在较大变异袁其中育性
11、变异表现最突出遥 前人关于不育再生植株的细胞学分析及探究棉花体细胞组织培养对不育变异影响的研究较多袁研究发现造成再生植株不育的主要原因是染色体数目和结构变异7-10遥 陈志贤等7对棉花体细胞培养再生不育株的性状及细胞学研究中发现袁与再生可育株相比袁不育植株的分枝尧叶尧花和植株等均较小袁花柱尧柱头尧花丝尧花药小且萎缩呈干瘪状袁花药不开裂曰不育株花粉母细胞减数分裂异常袁普遍出现染色体丢失尧配对异常尧单价体和染色体桥袁形成二分体尧三分体或多分体曰不育株雄配子体和雌配子体发育异常袁 胚囊结构不完整袁反足细胞解体延迟袁造成不育遥Bajaj等8尧郭香墨等9对陆地棉体细胞培养的染色体进行研究袁发现愈伤组织细
12、胞的染色体数目变异较大遥 王坤波等10对转基因棉花早代材料细胞学变异的研究揭示了染色体数目的减少尧花粉母细胞染色体结构变异是转基因棉花高度败育的直接原因遥 组织培养时间延长也会导致棉花体细胞的变异袁Stelly等11尧张宝红等12在棉花组织培养中的表型变异研究证明袁随着培养时间的延长袁染色体变异的频率升高尧畸形胚增多尧变异的性状和变异的范围扩大袁表明培养时间是造成变异的重要原因之一遥 薛美凤等13研究发现体细胞胚胎发生能力虽然可保持较长时间袁 但随着继代时间的延长袁再生能力逐渐下降袁畸形胚发生率和再生植株不育率逐渐升高遥 在对不同品种棉花体细胞再生植株育性研究中,亓建飞等5发现不同品种的胚状体
13、均存在染色体变异袁 以染色体数目为2752条的非整倍变异最多袁且不同品种的染色体变异率差别大袁其中胚胎发生能力弱的品种的染色体变异率高遥 在棉花基因功能及转基因新种质创制的研究中袁如何降低棉花遗传转化过程中的不育株率是亟待解决的问题之一遥 为探究不同转化载体大小尧目标基因片段大小尧出愈-分化的组织培养时间尧分化-再生植株渊简称为分化-再生冤的组织培养时间对育性的影响袁对6个不同转化载体和插入片段大小的转基因再生植株育性进行研究袁分析造成转基因T0植株不育的原因袁 为棉花遗传转化体系改良提供理论依据遥材料和方法试验材料遥 试验以体细胞胚胎发生能力较强的棉花品种冀合713为转基因受体材料遥农杆菌培
14、养所用培养基为通用的LB培养基袁 农杆菌介导的棉花遗传转化过程及棉花组织培养所用培养基如表1所示遥本试验所用植物表达载体来源于中国农业科学院棉花研究所郑州科研中心刘传亮课题组遥 利用聚合酶链式反应渊poly-merase chain reaction袁PCR冤和酶切技术进行目标载体的构建袁农杆菌菌株均为LBA4404袁植物表达载体详细信息见表2袁 载体构建所用引物信息见表3遥分别挑取携带目的基因的农杆菌菌落接种于LB液体培养基中袁28 振荡培养过夜至600值为0.30.7袁 将培养过夜的农杆菌稀释数百倍后在含有50 mg窑L1卡那霉素和25 mg窑L1利福平的LB固体培养基上划线袁在28 条件
15、下培养24 h后保存袁每隔2罗晓丽等院转基因棉花再生植株育性影响因素研究23135 卷棉花学报个月继代活化一次遥 转化前挑取混合单菌落袁接种到LB液体培养基 渊含50 mg窑L1卡那霉素和25 mg窑L1利福平冤袁2628 振荡培养 渊180200 r窑min1冤过夜渊约24 h冤至对数生长期渊600值为0.30.5为宜袁肉眼观察利福平的红色正好褪去冤遥 将培养至对数生长期的农杆菌菌液用液体LB稀释100倍袁 加入50 mg窑L1乙酰丁香酮渊acetosyringone,AS冤袁2628 振荡培养渊180表 2植物表达载体信息Table 2Information of plant expres
16、sion vectors载体编号Vector code载体Vector筛选抗生素Selection antibioticL47pBI121-cas9-gus卡那霉素 KanamycinL74pCAMBIA2300RD113p-cpf1-GoPGF卡那霉素 KanamycinL77pCAMBIA2300RZmUbip-cpf1-GoPGF卡那霉素 KanamycinL78pCAMBIA2300R35sp-cpf1-crRNA-GoPGF卡那霉素 KanamycinL79pCAMBIA230035s-GFP-HA-GhMML9卡那霉素 KanamycinL80pCAMBIA2300-35s-RNA
17、i-GhMML9卡那霉素 Kanamycin插入基因大小Transgeneinsertion size/kb载体大小Vector size/kb4.1318.83.8015.13.8015.93.8014.40.9010.81.0010.8表 1棉花组织培养所用培养基Table 1The medium for culture培养基Medium组成成分ComponentsMSMurashige and Skoog 培养基渊M519,PhytoTechnology Laboratories袁美国冤Murashige and Skoog medium渊M519,PhytoTechnology Lab
18、oratories袁USA冤M01/2 MS20 g 窑 L1葡萄糖3.0 g 窑 L1植物凝胶,pH 6.51/2 MS20 g 窑 L1glucose+3.0 g 窑 L1phytagel,pH 6.5M1MS 无机盐 渊硝酸钾加倍冤10 mg 窑 L1维生素 B130 g 窑 L1葡萄糖3.0 g 窑 L1植物凝胶,pH 6.8 MSmineral salt 渊doubled potassium nitrate冤+10 mg 窑 L1vitamin B1+30 g 窑 L1glucose+3.0 g 窑 L1phytagel,pH 6.8M2M1+0.1 mg 窑 L12,4-D*+0.
19、1 mg 窑 L1KT*M3M2 培养基100 mg 窑 L1卡那霉素500 mg 窑 L1头孢霉素M2 medium+100 mg 窑 L1kanamycin+500 mg 窑 L1cefotaximM4M1 培养基100 mg 窑 L1卡那霉素500 mg 窑 L1头孢霉素M1 medium+100 mg 窑 L1kanamycin+500 mg 窑 L1cefotaximM5M1 培养基渊去掉硝酸铵袁植物凝胶冤0.5 g 窑 L1天冬酰胺1.0 g 窑 L1谷氨酰胺M1 medium(without potassium nitrate and phytagel)+0.5 g 窑 L1as
20、paragine+1.0 g 窑 L1glutamineM6M1 培养基渊去掉硝酸铵袁植物凝胶袁葡萄糖冤0.5 g 窑 L1天冬酰胺1.0 g 窑 L1谷氨酰铵M1 medium(without potassium nitrate,phytagel,and glucose)+0.5 g 窑 L1asparagine+1.0 g 窑 L1glutamineM7M1 培养基渊去掉硝酸铵袁植物凝胶袁葡萄糖冤0.5 g 窑 L1天冬酰胺1.0 g 窑 L1谷氨酰铵M1 medium(without potassium nitrate,phytagel,and glucose)+0.5 g 窑 L1as
21、paragine+1.0 g 窑 L1glutamine注院*2袁4-D院2袁4-二氯苯氧乙酸曰*KT院6-糖基氨基嘌呤遥Note:2,4-dicholrophenoxyaceticacid曰*KT院6-furfurylaminopurine.2323 期次诱导筛选培养1个月袁获得的阳性愈伤组织继代于增殖培养基M1中遥 将增殖培养期间分化的胚性愈伤组织转入M5培养基中袁记录每个转化体渊独立的胚性愈伤组织冤的分化时间并编号袁未分化的愈伤组织继续在增殖培养基M1中继代培养至分化遥 在M3渊二次诱导筛选冤或M4渊二次筛选冤培养基上继代培养期间有些转化体直接在外植体上产生胚性愈伤组织或体细胞胚胎袁这些
22、胚性愈伤组织或体细胞胚胎不需要在M1培养基中的增殖培养袁而是直接转入M5培养基上进行分化培养渊这些转化体产生的再生植株所需的分化-再生的时间往往小于110 d冤遥 将在150 d以内形成的胚性愈伤组织转入M5分化培养基中袁继代培养至愈伤组织分化长成胚状体后转入M6培养基中袁 在M6培养基中培养形成的小植株在无菌条件下继代转入成苗培养基M7中袁继200 r窑min1冤0.51.0 h备用遥试验方法本研究参考已发表的转化方法和棉花组织培养方法14-16袁以下胚轴切段为外植体将表2中6个转化载体进行转化袁经过共培养尧筛选尧愈伤组织诱导尧胚性愈伤组织分化尧体细胞胚胎发生尧植株再生尧再生植株嫁接等过程袁
23、最终获得转基因植株遥遥 于2018年11月13日尧11月27日尧12月11日分别对6个载体进行了3次转化渊即3次重复冤袁每次重复每个载体转化的外植体数为320渊下胚轴切段数冤遥 农杆菌浸染后的下胚轴外植体在M2培养基共培养后转入诱导筛选培养基M3中黑暗培养1个月尧光培养1个月袁这个时期下胚轴外植体膨大并有愈伤组织生长袁 将直径12 cm的愈伤组织转入M4筛选培养基中二次筛选培养1个月袁而小于1 cm的愈伤组织再次转入M3筛选培养基中进行二表 3转基因植株鉴定所用的引物Table 3Primers for detecting transgenic plants载体编号Vectorcode引物序列
24、PrimersequenceL47GCCTTAGCATCAACACCAGAAGCTTTCATTTGGAGAGAACACGGGGL74GTTCTCTGAAGAAGCTAAGTCTACCATCATATTCAGCATTCCACL77GTTCTCTGAAGAAGCTAAGTCTACCATCATATTCAGCATTCCACL78GGGTGGTTGGGATAAGGATAAGGGGAGAATTAGCAGGATGAACAACL79GAGACTGGAGGTTGTCAGTTGTGTTTCATTTGGAGAGAACACGGGGL80GAATTCGAACATGGAATCCAGGTATCGGTACCATCTGGCCAT
25、CAGGCTGTTAAC表 4不同阶段培养时间及继代次数Table 4Culturing time and subculturing times at various stages培养基Medum作用Function一次继代培养时间Culturing time/d继代次数Subculturing timesM0无菌苗培养 Culturing sterile seedling51M2共培养 Co-cultivation21M4筛选培养 Callus induction and selection25301M1增殖培养 Callus proliferation304023M5分化培养 Callus
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