KJ 201705 水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测胶体金免疫层析法.pdf
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1、 附件 5 水产品中硝基呋喃类代谢物的快速检测 胶体金免疫层析法(KJ201705) 1 范围 本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。 本方法适用鱼肉、 虾肉、 蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物 (AOZ) 、 呋喃它酮代谢物 (AMOZ) 、呋喃西林代谢物(SEM) 、呋喃妥因代谢物(AHD)的快速测定。 2 原理 样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后,其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线(T 线)上硝基呋喃类代谢物-BSA 偶联物的免疫反应,从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线(C 线)颜色深浅比较,对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。
2、 3 试剂和材料 除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 盐酸。 3.1.2 三水合磷酸氢二钾。 3.1.3 氢氧化钠。 3.1.4 甲醇。 3.1.5 乙醇。 3.1.6 乙腈。 3.1.7 邻硝基苯甲醛。 3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。 3.1.9 乙酸乙酯。 3.1.10 正己烷。 3.1.11 邻硝基苯甲醛溶液(10mmol/L):准确称取 0.150g 邻硝基苯甲醛,用甲醇(3.1.4)溶解并定容至 100mL。 3.1.12 磷酸氢二钾溶液(0.1mol/L):准确称取 22.822g 三水合磷酸氢二钾(3.1.2
3、),用水溶解并定容至 1000mL。 3.1.13 氢氧化钠溶液 (1mol/L) : 准确称 39.996g 氢氧化钠 (3.1.3) , 用水溶解并稀释至 1000mL。 3.1.14 盐酸溶液(1mol/L):取 10mL 盐酸(3.1.1)加入到 110mL 水中。 3.1.15 三羟甲基氨基甲烷溶液(10mmol/L):准确称取 1.211g 三羟甲基氨基甲烷(3.1.8),溶于 80mL 水中,加入盐酸(约 42mL)调 pH 至 8.0 后用水定容至 1L。 3.2 参考物质 3.2.1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量见表 1,纯
4、度99%。 表 1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子量 中文名称 英文名称 CAS 登录号 分子式 相对分子量 3-氨基-2-恶唑烷酮 3-anmino-2-oxazolidinone,AOZ 80-65-9 C3H6N2O2 102.09 5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮 5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ 43056-63-9 C8H15N3O3 201.22 1-氨基-2-乙内酰脲盐酸盐 1-Aminohydantoinhydrochloride,AHD 2827-56-7 C
5、3H5N3O2 HCl 151.55 氨基脲盐酸盐 semicarbazidhydrochloride,SEM 563-41-7 NH2CONHNH2 HCl 111.53 注:或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液的配制 3.3.1 标准储备液: 分别准确称取适量参考物质 (精确至 0.0001g) , 用乙腈溶解, 配制成 100mg/L的标准储备液。-20冷冻避光保存,有效期 12 个月。 3.3.2 混合中间标准溶液:准确移取标准储备液(3.3.1)各 1mL 于 100mL 容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成浓度为 1mg/L 的混合中间标准溶液。4冷藏避光保存,有效期 3 个月。 3
6、.3.3 混合标准工作溶液:准确移取 0.1mL 混合中间标准溶液(3.3.2)于 10mL 容量瓶中,用乙腈定容至刻度, 配制成浓度为 0.01mg/L 的混合标准工作溶液。 4冷藏避光保存, 有效期 1 个月。 3.4 材料 3.4.1 AOZ 试剂盒(含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂)。 3.4.2 AMOZ 试剂盒(含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂)。 3.4.3 SEM 试剂盒(含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂)。 3.4.4 AHD 试剂盒(含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂)。 3.4.5 固相萃取柱(强阴离子交换型):规格 1mL,填装量为 60mg。 4 仪器和设备 4
7、.1 电子天平:感量分别为 0.1g 和 0.0001g。 4.2 均质器。 4.3 水浴箱。 4.4 离心机。 4.5 氮吹仪或空气吹干仪。 4.6 移液枪:10L,100L,1000L,5000L。 4.7 涡旋振荡仪。 4.8 胶体金读数仪(可选)。 4.9 固相萃取装置(可选)。 4.10 环境条件:温度 15-35,湿度80%。 5 分析步骤 5.1 试样制备 按照方法要求, 称取一定量具有代表性样品可食部分 (注: 甲壳类, 试样制备时须去除头部) ,用于后续实验。 5.2 试样提取和净化 称取适量的匀浆样品(以试剂盒操作说明书要求来定,精确至 0.01g)于 50mL 离心管。
8、5.2.1 方法一(液液萃取法) 称取 2g 0.05g 均质组织样品于 50mL 离心管中,依次加入 4mL 去离子水、5mL1mol/L 盐酸(3.1.14)和 0.2mL10mmol/L 邻硝基苯甲醛溶液(3.1.11) ,充分振荡 3min;将上述离心管在 60水浴下孵育 60min;依次加入 5mL0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液(3.1.12) ,0.4mL1mol/L 氢氧化钠溶液(3.1.13) ,乙酸乙酯 6mL,充分混合 3min,在室温(2025)下 4000r/min,离心 5min;移取离心后的上层液体 3mL 于 5mL 离心管中,60下氮气/空气吹干;向吹干的离心
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