NY∕T 2288-2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法(农业).pdf
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1、ICS 65.020 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 2288-202 代替Nyrr22日8-2012黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法Detection and Identification method of Cucumber green mottle mosaic virus 2021-05 -07发布2021-11-01实施 ,.(V)生-矿l中华人民共和国农业农村部发布NY /T 2288- 2021 起草.本立;何代替NY/T 2288-2012(黄瓜绿斑驳.E11十病毒检疫检测与鉴定方法),与NY/T 2288-2012 相比,1徐结构调整和编i:
2、Wl改jJ外,主要技术变化如下:a) 逆转录聚合附链式反应检测法反应体系运用的引物修改为更为灵敏的CGMMV-654F/ CGM MV-654R引物序列(上游寻|物PrimcrF: 5CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3 ;下游引物PrimerR, 5 -CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3); b) 修订了结果判定逻辑顺序,调整为典型症状初步判断,快速检测高度疑似,网版免疫吸附测定法和l逆转录聚合同电储式反应检测法最终判定;c)曾111了科i案保存1;1节及要求,CI) 修订了样品取样盐的规定,区分了躲实和IIt片的取样盐。jjf注意本文件的某些内容可能涉及专利
3、。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件m农业农村都种植业管理司提出。本文件111全同植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271 )归口。本文伺起草单位。全同农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、辽宁省绿色农业发展中心、四川省农业农村厅柏物检疫站、四川农业大学。本文ftI主要起草人王桶样、王晓亮、吴元华、豆子蒙、毕躲月、蔡圳、扫冬、郭迪金、李小松、何珊、尚静。本文件及其所代替文ftlf10JJj次版本发布啊i况为2012年首次发布为lY/T 2288- 2012 ; 一一本次为第一次修订。NY / T 2288- 2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法1 范围本文件规定丁黄瓜绿斑
4、驳花叶病毒的取样方法、检疫检测、结呆判定和l报告、样日,处础和档案保存.本文件适用于农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内仅i主日期对应的版本文件。GB 15569 GB/ T 28071 4 原理5 CNaN3) , 市售商陪标抗体、所有试剂均6 仪器及用具7 取样7. 1 种子取样数量与方法按GB15569的规定进行,取样要充足,具有代表性。7.2 叶片及果实d。其中,注日期的引用文件,所有的修改11)适用于本钥I(KH,PO,)、H)、11氮化制、市售抗体、nl免洗板机、微量1m样|殖机选取发病或疑似发病叶片或果实,以J嫩11十片和l果实为主。
5、每份月2实样品不少于200 g,Uj-j牛不少于10g,装入自封袋中密封4C保存,并注明植物名称、采集时间、地点、采tt人等信息。B 检测8 1 症状检查检查Iq片、果梗、果实,与黄瓜绿斑驳花Iq一病毒病的典型症状进行比较(见附录B)。NY! T 2288-2021 8 2 快速诊断快速珍lJfr试纸条或断J剂盒检测法见附录c如l采用市售的试纸条或试卉。盒,按说明操作。8. 3 酶联免疫吸附测定黄瓜绿斑驳花III病毒附联免疫l吸附测定法见附录00如采用市岱的试)盒,按说明操作。8 4 逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR)14二瓜绿斑驳花11十病都逆转录聚合酶链式反应检测法(R下PCRl见附
6、录E。如采用市您的试剂盒,按说191操作。9 结果判定和报告9. 1 结果判定9.11 典型症状*实发病且符合典型症状,可初步步1)定。9.12 快速诊断结果快速诊断试纸条或i牵邸r试剂盒检测结果为阳性的,可判定为高J3r疑似。9.13 酶联免疫吸附测定法在阴性对!阳光密皮他OO血;0.1 .且附rt对!00值大于阴性对照00值21行的前提下,样品孔00值大于)j性x.J.!00 值2倍时,判定为阳性反应,eJl样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。9.1.4 逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR)观察电泳结巢,在|咽性对!l在654bp处有条带出现,且空白、阴性对!ft无条带出现的前挺下,待测样ITt
7、在654bp处有条销出现,判定为阴性反应,即样品带黄瓜绿斑驳花Iq-病毒.9 15 结果报告将鉴定结*:11人附录F的植物有害生物样本鉴定报告中。10 样品处理检测过程中使用的有关材料和l用具,在使用完毕后须进行消毒和iI徐害处型。经检疫鉴定后的种子样品应保存在C冰箱内,11)片和l柴实样品应保存在一20C以下6个月备企,保存期满后,进行灭活处斑。11 档案保存采样信息、鉴定报告等原始资料妥普保存子植物检疫机构,保存期至少一年。2 A 1 包被缓;中液附录A(资料性)试jfIJ配制方法NY /T 2288- 2021 -Ia2CO, 1. 59 g,Na HCO, 2. 93 g,NaN, O
8、 . 2 g,去离子水定谷至1000mL.调整pH至9.6,4C储存。A.2 洗涤缓冲液-Ia2-PO, 1. 15 g,(H2PO, 0. 2 g,NaCI 8. 0 g,(CI O. 2 g,IUjlii,-20 O. 5 g去离子水定容至1000 mL, 调整pH至7.4,室11,1i/l存。A.3 提取缓冲液鸡蛋消粉2.0g,聚乙烯II ltll各烧阁(PVP. (30)(分子量4400054 000) 20. 0 g,Na2SO 1. 3 g,NaN, 0. 2 g,IH棉2020. 0 g i剔。早于1000mL lXPBST中,调整1-1至7.4.4C储存。A.4 酶标抗体缓;中
9、液牛.riJl活蛋白2.0 g,聚乙烯IIltll各院酬(PVP,(30) 10.0 g,NaN O. 2 g,浴解于1000 mL 1 X PBST中,调整pl-l至7.4,4C储存。A. 5 底物缓冲液二乙醇j除97.0mL,MgCI, O. 1 g,NaNJ 0.2 g,去离子7(定谷至800mL,调整p-1至9.8,4C1,吉存。3 NY / T 2288-2021 附录B(资料性)黄瓜绿斑驳花时病毒基本信息8.1 寄主范围西瓜、胡芦、黄瓜、南瓜、组瓜等瓜类作物。8.2 生物学特性8. 2 1 致死温度90 oC-IOO oC 8. 2. 2 稀释限点10-7 mL/ L-1O mL/
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