真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索.pdf
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1、第 卷第期 年月杭州师范大学学报(自然科学版)()收稿日期:修回日期:基金项目:国家自然科学基金项目()通信作者:童骏森(),男,副研究员,博士,主要从事结构生物学研究 :犱 狅 犻:真核表达肝药酶犝 犌 犜 犃 可溶重组蛋白方法探索尹鑫俐,戚旭丹,涂予溪,陆茜,杨元,陈侠斌,童骏森(杭州师范大学药学院,浙江 杭州 )摘要:葡萄糖醛酸基转移酶()是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制本研究以制备 可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及 长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组 的大量制备 细胞分泌表达的 (氨基酸
2、 )重组蛋白经 亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经 、及 检测鉴定为目的蛋白,通过 法测得重组蛋白最终产量为,纯度达到 以上本研究建立了一种人源药物代谢酶 的可溶重组蛋白表达纯化方法,为 及 同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础关键词:药物代谢酶;真核表达;蛋白纯化中图分类号:文献标志码:文章编号:()尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(,)是一类重要的代谢酶家族,在动物、植物以及微生物体内都有广泛分布人源 是人体二相代谢中的关键酶,具有糖基化功能,能将糖基供体如尿苷二磷酸葡萄醛酸()上的糖基转移到外源或内源亲脂化合物上,使这些化合物的水溶性增强易于排出 不仅代谢花生四烯酸等内
3、源性脂肪酸,还参与多种处方药如阿片类药物、抗癫痫药和抗病毒药物的糖醛酸化代谢,因此被认为是主要的药物代谢酶然而,人 是具有 个同工酶的超家族,同工酶之间序列相似、结构相近,对代谢底物的特异性情况复杂 代谢活性已被证实与高胆红素血症等代谢类疾病及多种癌症 密切相关,但其催化机制和底物选择性等研究一直因缺乏酶结构域的结构信息而难以深入人源 通过羧基端跨膜肽段定位于光滑内质网()上 ,氨基端存在内质网信号肽,使其全酶结构域可溶重组蛋白的获得十分困难 ,尚未有完整 酶结构域全长三维结构被报道 通过 从头计算、同源建模等方法预测发现,人 酶结构域的氨基端柔性较强,构象不稳定,可能是造成可溶重组 制备困难
4、的主要原因目前对 功能研究主要以研究肝微粒体()重组蛋白原位表达的形式进行,尚未见到通过添加融合蛋白标签稳定三维构象提高溶解度的方法制备重组蛋白的研究报道而融合蛋白标签如 等,已被证实具有提高蛋白表达量和溶解度,增强稳定性的作用,因此,通过筛选优化表达系统并添加促溶标签对重组 的可溶蛋白制备具有积极意义人源 属于 同工酶超家族中的 家族 ,在人类肝脏和肾脏中大量表达 药物代谢酶 参与内源性雌激素 和甲状腺激素 的代谢,以及恩他卡朋、异丙酚和霉酚酸等多种治疗药物的代谢 对 及其家族 的重组蛋白功能研究,主要以肝微粒体形式进行,尚无 全酶结构域重组蛋白的表达纯化方法报道,导致无法通过结构生物学等手
5、段明确其底物选择性的结构基础和催化反应的关键机制,以及准确测定对药物代谢的酶动力学常数本研究通过合成人源药物代谢酶 关键结构域基因,采用单酶切结合同源重组的方法,利用 和融合蛋白 进行修饰后,插入真核表达载体构建重组质粒 通过优化融合蛋白 和 之间 长度及蛋白纯化条件,成功建立一种高效的人源药物代谢酶 的真核表达及纯化方法,蛋白表达量可达 ,蛋白纯度在 以 上本研 究 为 后续 蛋白的药物代谢选择性研究及催化分子机制研究奠定基础材料与方法 实验材料 细胞及质粒大肠杆菌犈犮 狅 犾 犻 购于北京擎科生物科技有限公司对数生长期的 细胞购自永联生物科技(上海)有限公司目的基因 (:)由北京擎科生物科
6、技有限公司合成质粒 是由本实验室改造并构建,所含抗性为氨苄青霉素抗性 主要试剂及仪器分子克隆过程中所用 购自日本 公司,限制性内切酶犅 犪 犿 购于美国 公司,限制性内切酶犖 犺 犲购于碧云天生物技术公司 细胞基础培养基购自永联生物科技(上海)有限公司;无血清培养基购自美国 公司;聚乙烯亚胺()购自美国 公司 购自江苏亲科生物研究中心有限公司;购自杭州宝科生物科技有限公司 、凝胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技有限公司核苷酸引物合成和 测序由北京擎科生物科技有限公司完成亲和层析介质 购自生工生物工程(上海)股份有限公司酶标仪为 公司仪器;接触成像仪为 公司仪器;质谱仪为 公司
7、仪器 实验方法 蛋白的生物信息学预测分析根据美国生物技术信息中心()数据库 ,获得 蛋白的氨基酸全长序列(位氨基酸),使用 (:)预测蛋白的相对分子质量、等电点、的消光系数等基本理化性质用 软件同源建模得到 的全长三维结构,在软件 (:)中分析蛋白结构特点 目的基因 的 扩增及 质粒线性化根据 上 氨基酸序列,人工合成哺乳动物细胞密码子优化的基因序列,用该基因序列设计克隆 引物含犅 犪 犿 酶切位点()的上游引物序列:;下 游 引 物 序 列:含犖 犺 犲酶切位点()的上游引物序列:;下游引物序列:以人工合成的全长 的 为模板,进行 扩增,反应条件:预变性 ;变性,退火,延伸,共 个循环;再延
8、杭州师范大学学报(自然科学版)年伸 质粒 分别使用犖 犺 犲、犅 犪 犿 单酶切线性化,反应条件:水浴锅反应酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,进行切胶回收 重组质粒的构建、转化与表达鉴定将 扩增得到的目的基因片段和线性化载体用犇 狆 狀酶消化去除模板 后,参照 重组酶()的说明书构建重组 质 粒,反 应条 件 为 ,目的 蛋白 的 末端用个组氨酸标签、融合蛋白 及 蛋白酶裂解位点()依次标记转入酶连产物的大肠杆菌 感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素()的 平板上,培养过夜次日挑取单个菌落接种到 含有氨苄青霉素的 液体培养基中,震荡培养至 为 后进行菌落 验证重组质粒,并通过菌液测序进一步确定序列的正
9、确性 蛋白表达及纯化采用聚乙烯亚胺()为转染试剂(质量浓度:),与质粒的比例为 将重组真核表达载体转染 ,转染时用无血清培养基稀释转染试剂和质粒,后开始收集细胞上清液将上清液与 介质混合并于孵育,然后用倍柱体积的裂解缓冲液(,咪唑)清洗介质以除去杂蛋白用洗脱缓冲液(,咪唑)洗脱目的蛋白浓缩目的蛋白,采用 法测定蛋白浓度,目的蛋白经 电泳,用考马斯亮蓝染色法鉴定其位置大小与纯度,用于后续研究 目的蛋白 鉴定蛋白经 电泳分离后,电转至聚偏二氟乙烯()膜(电转条件为 ,)脱脂奶粉室温封闭;弃封闭液,加入 抗体(小鼠单抗),于摇床孵育过夜;封闭过夜的 膜用 缓冲液洗涤次,次加入 抗体室温孵育,弃二抗液
10、体,用 缓冲液洗涤次,次 膜上均匀滴加 发光液,用 接触式化学发光成像系统进行扫描成像 目的蛋白 鉴定蛋白样品采用 胶进行电泳分离,将目的蛋白的胶条切下溶解后采用胰蛋白酶酶切质谱仪扫描所有生成的肽段离子并记录各级质谱的质荷比()和丰度序列数据库搜索软件以实验质谱数据与计算机模拟的理论酶切质谱数据相比较,通过计算机模拟理论酶切并设置过滤参数从而得到目标序列搜库软件比对实验谱图和理论谱图之后给出带有打分值的覆盖率()以及肽段谱图匹配(,)数据,其打分值标识出实验数据的可信度结果与分析 犝 犌 犜 犃 蛋白生物信息学分析 蛋白全长 个氨基酸,计算可知其相对分子质量约为 ,等电点为 ,波长下的消光系数
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