育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性.pdf
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1、DOI:10.12289/j.issn.1008-0392.23144临床研究 收稿日期:2023-05-02 作者简介:王 潇(1989),女,主治医师,硕士.E-mail:xiaoxiaowang1205 通信作者:浦筱雯.E-mail:puxiaowen 育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性王 潇,陈至柔,浦筱雯(同济大学附属第一妇婴保健院宫颈科,上海 201204)【摘要】目的 研究育龄期妇女从 HPV 感染到宫颈鳞状上皮内瘤变(squamous intraepithelial lesion,SIL)过程中的宫颈菌群组成和变化。方法 对 40 名参与者(年龄 21 49 岁)
2、的宫颈分泌物菌群 16S rDNA 进行了特征分析,其中包括高级别鳞状上皮内瘤变组(HSIL)、低级别鳞状上皮内瘤变组(LSIL)、单纯 HPV 感染组Ctrl HPV(+)和健康对照组Ctrl HPV(-),每组各 10 例。样本内的 多样性采用 Species 和 Shannon 指数,样本间的 多样性采用非度量多维尺度分析(NMDS)。利用线性判别分析效应大小(LEfSe)比较菌群的相对丰度。通过共现分析确定标记属之间的相关性,并通过 PICRUSt 探索宫颈菌群的功能特征和途径。结果宫颈分泌物 pH 值随疾病进展显著上升(P0.05),且 HPV 感染状态及亚型在 4 组间显著不同(P
3、0.05),但 多样性差异有统计学意义(P0.05),且 LSIL 和HSIL 组菌群结构明显偏离Ctrl HPV(-)和Ctrl HPV 组。LEfSe 分析获得11 个标记属,包括HSIL 的Bifidobacterium、Megasphaera、Gemella 和 Mucispirillum,以及 LSIL 的 Klebsiella、Capnocytophaga 和 NB1-j。共现性网络分析显示,Helicobacter、Clade_和 Aureimarina 与其他标记属共现相关性最强,且绝大多数呈现正相关。相关性分析显示,上述 11 个差异属与差异 KEGG 途径相关,而其他差异属
4、无相关结果;与 Klebsiella 相关的差异功能途径,大多数与Mucispirillum 的关联性相反。结论 育龄期女性在 SIL 发生的不同阶段,宫颈菌群结构存在差异。标记属可能参与病变进展,其或将有助于 SIL 的诊断、预防和治疗。【关键词】鳞状上皮内瘤变;宫颈菌群;HPV;16S rRNA【中图分类号】R711【文献标志码】A【文章编号】10080392(2023)04052609Characteristics of cervical microbiota and its relationship with squamous intraepithelial lesion among
5、reproductive womenWANG Xiao,CHEN Zhirou,PU Xiaowen(Department of Cervical Disease,Shanghai First Maternity and Infant Hospital,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 201204,China)【Abstract】ObjectiveTo characterize cervical microbial feature during the progression from chronic cervicitis to sq
6、uamous intraepithelial lesion(SIL)in women of childbearing age.Methods We characterized the 16S rDNA of cervical secretion from 40 participants aged 2149 years.Participants were divided into HSIL group(high-grade SIL),LSIL group(low-grade SIL),Ctrl HPV(+)group(histopathologically normal while HPV-po
7、sitive)and Ctrl HPV(-)group(healthy control)with 10 cases in each group.Species and Shannon indices were used for diversity within samples,and non-metric multidimensional scaling(NMDS)was used for diversity among samples.Linear discriminant 625第 44 卷第 4 期2023 年 8 月同 济 大 学 学 报(医 学 版)JOURNAL OF TONGJI
8、 UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.44 No.4Aug.2023analysis effect size(LEfSe)was used to compare the relative abundance of the microbiota.Correlation between marker genera was determined by co-occurrence analysis,and functional characteristics and pathways of cervical microbiota were explored by PICRUS
9、t.ResultsThe pH of cervical secretions increased significantly with disease progression(P0.05),and HPV infection status and subtypes were significantly different among the 4 groups(P0.05),whereas the difference of diversity was statistically significant(P0.05),and the microbial structure of LSIL and
10、 HSIL groups was significantly different from that of Ctrl HPV(-)and Ctrl HPV groups.Eleven marker genera were identified by LEfSe analysis,including Bifidobacterium,Megasphaera,Gemella and Mucispirillum from HSIL,and Klebsiella,Capnocytophaga and NG1-J from LSIL.Co-occurrence network analysis showe
11、d that Helicobacter,Clade_ and Aureimarina had the strongest co-occurrence correlation with other marker genera,and most of them showed positive correlation.Further correlation analysis showed that the above 11 difference genera were correlated with differential KEGG pathway,while the other differen
12、ce genera had no correlation results.Klebsiella and Mucispirillum were inversely associated with most KEGG pathways.ConclusionIn women of childbearing age,the structure of cervical microbiota is different at different stages of SIL.Marker genera may be involved in the progression of lesions,which mi
13、ght be used for diagnosis,prevention and treatment of SIL.【Key words】squamous intraepithelial lesion;cervical microbiota;human papillomaviruses;16S rRNA 众所周知,阴道菌群对女性健康至关重要。目前已在阴道中鉴定出 50 多种细菌,其中以乳杆菌属(Lactobacillus)为主(占总数的约 70%),主要包括L.crispatus、L.gasseri、L.inners 和 L.jensenii1-2。阴道中其他关键物种包括厌氧菌(Gardner
14、ella、Atopobium、Mobiluncus、Prevotella、Streptococcus、Staphylococcus、Ureaplasma 和 Megasphaera)和共生微生物,如机会性真菌 Candida albicans3。遗传倾向、种族、饮食和生活方式、卫生状况、感染、人类行为如抗生素使用、性生活和阴道的生理状态,特别是雌激素都会影响阴道菌群的整体结构或功能以及微妙的平衡状态2,4。在女性生殖周期和绝经期的不同阶段,阴道菌群也具有不同的群落结构和组成5。子宫颈癌是临床上第 3 大最常见的女性癌症,也是15 44 岁女性第2 大最常见的癌症6。绝大部分宫颈癌是因高危人乳头
15、瘤病毒(HPV)持续感染引起,其通常会经历漫长的鳞状上皮内瘤变(squa-mous intraepithelial lesion,SIL)的癌前病变过程。已有报道显示,阴道菌群组成差异可能参与宿主对HPV 感染的易感性和持久性,以及随后的不典型增生、上皮内瘤变和肿瘤病变的发展7。本研究中,为减少雌激素的影响,采集育龄期妇女宫颈分泌物,采用 16s rDNA 测序比较宫颈菌群,并通过组织病理学诊断预测其与 SIL 的相关性,旨在探讨宫颈菌群的特征及其与 SIL 发生发展的关系,为通过改变宫颈菌群来预防和治疗 SIL 提供理论依据。1 资料与方法1.1 研究对象收集 2022 年 4 月2022
16、年 12 月于同济大学附属第一妇婴保健院妇科就诊的 HPV 阳性且子宫颈液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test,TCT)结果高级别鳞状上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)的患者,进一步做阴道镜检查和宫颈组织活检,或根据阴道镜活检结果进一步行 LEEP 术以明确宫颈病理结果。参与者的纳入标准为:(1)在过去 3 d 内没有性生活或阴道冲洗;(2)过去 1 个月内没有使用抗生素、益生菌或避孕产品;(3)没有艾滋病毒或乙725 第 4 期王 潇 等:育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性型/丙
17、型肝炎病毒感染;(4)既往无内分泌或自身免疫性疾病或恶性肿瘤病史。参与者的排除标准为:在抽样时处于怀孕、哺乳或月经期。根据宫颈组织的病理结果将患者分为单纯 HPV 感染Ctrl HPV(+)、低 级 别 鳞 状 上 皮 内 瘤 变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)和高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL),每组纳入 10 例。此外还纳入了同期收集的 10 例组织病理学诊断为宫颈炎的患者作为对照组。1.2 样本采集方法受检者卧于检查床上,臀部靠近床边,两腿分开放到支腿架上,用阴道窥器充分暴露宫颈阴道部,用一次性无菌拭子在宫颈口收集宫颈黏液分泌
18、物,然后用刷子收集宫颈脱落细胞,分别进行 HPV 和 TCT检测。收集完成的分泌物样本放入专用无菌拭子管中,随后立即放入液氮中,运至实验室保存在-80 冰箱直至提取。1.3 观察指标及方法1.3.1 HPV、子宫颈液基细胞学检测及判断标准使用罗氏 HPV 检测平台进行 HPV 分型检测,结果分为 HPV16 型、18 型、其他类型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型)阳性;采用液基分离并滤掉标本中的黏液、血液、炎症组织,全自动Tripath 染色、制片。由专业病理医师根据 TBS 系统进行细胞学判读。1.3.2 子宫颈组织病理学诊断方法及标准依据阴道镜操
19、作规范采用光电一体阴道镜对 HPV 阳性且 TCTASC-US 的患者进行宫颈组织活检。必要时,按照 LEEP 刀标准操作流程对患者进行 LEEP术。宫颈组织标本送病理科,由专业病理医师阅片,根据组织细胞异型性的程度和范围参考 WHO 的诊断标准及分类进行组织学诊断。1.3.3 宫颈分泌物 pH 检测使用爱威生殖道分泌物分析仪(AVE-321)检测宫颈分泌物的 pH 值。1.4 基因组 DNA 提取与扩增采用 DNA 抽提试剂盒对样本的基因组 DNA 进行提取,之后利用琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 检测DNA 的浓度。以基因组 DNA 为模板,根据测序区域的选择,使用带 barcode
20、的特异引物和 TaKaRa 公司的 Tks Gflex DNA Polymerase 进行 PCR,确保扩增效率和准确性。细菌多样性鉴定对应区域:16S V3-V4区(引物 343F:5-TACGGRAGGCAGCAG-3和 798R:5-AGGGTATCTAATCCT-3)。1.5 建库及测序PCR 产物使用电泳检测,检测后使用磁珠纯化,纯化后作为二轮 PCR 模板,并进行二轮 PCR 扩增,并再次使用电泳检测,检测后使用磁珠纯化,纯化后对PCR 产物进行 Qubit 定量。根据 PCR 产物浓度进行等量混样,在 Illumina NovaSeq6000 上进行读长为250 bp 的双末端测
21、序。原始数据为 FASTQ 格式。数据下机后,首先使用 cutadapt 软件,对 raw data 序列,剪切掉引物序列。然后使用 DADA2,将上一步合格的双端 raw data 按照 QIIME 2(2020.11)默认参数进行质量过滤,降噪,拼接及去嵌合体等质控分析,得到代表序列及 ASV 丰度表格。使用 QIIME 2 软件包挑选出各个 ASV(amplicon sequence variant)的代表序列后,并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S 使用 Silva(version 138)数据库比对。物种比对注释使用 q2-feature-classifier 软件默认参数进
22、行分析。1.6 生物信息学分析统计学比较采用 SPSS 23.0,通过 t 检验或 Chi-square 检验。使用 R 软件(v3.2.0)中的“Venn-Diagram”和“cor function”分别进行 Venn 图分析和相关性分析。系统发育树由 GraPhlAn 构建。通过比较多组间(Kruskal 检验)或两组间(Pairwise.wilcox.test)Species 和 Shannon 多样性指数评估样本内 多样性。使用 Binary-jaccard 距离指标进行 多样性分析,并通过非度量多维尺度分析(NMDS)进行可视化,PERMANOVA(permutational mu
23、ltivariate analysis of variance)估计各组间微生物群结构的分化8。采用 Anosim 分析检验群落结构差异。采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)评估组间微生物群落差异。将线性判别分析(LDA)与非参数的 Kruskal-Wallis 以及 Wilcoxon 秩和检验相结合,采用默认参数(LDA2)9筛选关键的微生物标志物。随机森林分析使用 R 软件包 randomForest。共现分析通过计算优势分类群之间的 Spearman 等级相关性进行,并使用 Cytoscape10实现网络
24、可视化。基于 KEGG功能模块11,利用群落系统发育研究(PICRUSt)方法对基因目录进行注释,预测微生物功能。通过Kruskal-Wallis 检验确定各组预测 KEGG 通路的统计学差异。P0.05;但 4 组宫颈分泌物 pH 值差异有统计学意义(P=0.018),且随着疾病进展呈上升趋势;HPV 感染状态及亚型在 Ctrl HPV(-)、Ctrl HPV(+)、LSIL 和 HSIL 组间显著不同(P16544pH5.930.996.581.056.750.547.220.680.018HPV 感染0.05,Shannon P0.05)(图 1B、C)。在 多样性上,不同组间菌群结构存
25、在明显的差异(PERMANOVA P=0.001),两两组间差异均有统计学意义,且 LSIL 和 HSIL 组的样本菌群结构明显偏离 Ctrl HPV(-)和 Ctrl HPV 组(图 1D)。样本层次聚类分析清晰地显示,LSIL 和 HSIL 组与 Ctrl HPV(-)和 Ctrl HPV(+)组为分开聚集,LSIL 组则介于 Ctrl HPV(+)和 HSIL 组之间,与它们相互聚类(图 1E)。根据分类群表计算的样本平均比例,宫颈样本中丰度最高的前 15 个门或属在各组中均不同,表明优势细菌分类群因群体或病变而异(图 1F G)。在门水平上,Ctrl HPV(-)组 Firmicute
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