阳虚型功能性胃肠病肠道菌群的差异性研究.pdf
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1、现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 临床经验阳虚型功能性胃肠病肠道菌群的差异性研究钟伟琴,李丙生,许岸高【摘要】目的观察阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性,为功能性胃肠病的中医中药治疗提供客观依据。将中医体质理论与现代肠道微生态理念结合起来为中西医结合“精准”治未病的未来研究提供部分参考。方法本次试验研究阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性。以健康志愿者和功能性胃肠病患者为研究对象,建立中医证候诊断,按照实验的纳入和排除标准筛选志愿者分为阳虚型实验组与平和型对照组,收取志愿者的大便样本()放入无菌容器内,于 小时内放入 冰箱内冷藏待检。提取粪便菌群总 ,使
2、用 高通量测序检测粪便肠道菌群的丰富度及多样性,进行统计学分析出两者间肠道菌群结构的差异性。结果阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人的肠道菌群丰度和多样性有一定变化,差异是不具统计学意义的()。从阳虚型功能性胃肠病患者与平和型健康人两组志愿者的肠道菌群结构方面来看,在门水平上,两组肠道菌群的优势菌门主要均为:变形菌门,厚壁菌门,拟杆菌门。在属水平上,阳虚型功能性胃肠病患者菌群中对机体有益的乳球菌属()、链型杆菌属()数量明显不足(),表明阳虚型功能性胃肠病肠道菌群结构存在一定变化,且背向于机体有益方向发展。结论阳虚型功能性胃肠病肠道菌群结构存在一定变化,且背向于机体有益方向发展。其变化具有显著
3、统计学意义。【关键词】肠道菌群;功能性胃肠病;体质辨证;高通量测序中图分类号:文献标志码:作者单位:广东省惠州市第一人民医院消化内科;广东省惠州市医学研究所通信作者:钟伟琴,:;李丙生,:;许岸高,:基金项目:广东省自然科学基金();惠州市科技计划项目(;)肠道微生物是寄生在我们肠道的一个庞大而复杂的微生态系统,肠道微生物自身以及它的代谢产物可以对人体健康进行调节 ,也可以在饮食和宿主之间起到一个重要的连接作用。肠道菌群的组成、种类、数量及其稳定性与遗传因素 、性别、分娩方式 、饮食结构 、生活环境、身体健康状况 等多种因素密切相关,其中,膳食因素被认为是最重要的因素之一,也是最容易被调控的因
4、素 。随着年龄的增长,肠道菌群的数量、种类逐渐增多直至成年后形成一个复杂而稳定的微生态系统,继而随着机体老化,肠道微生态稳定性逐渐变差,这也是老年人容易患病的原因之一。大量研究表明,肠道菌群作为疾病的“晴雨计”,是潜在的疾病标志物 ,肠道微生态失调是“万病之源”。因此,肠道菌群动态平衡与人体健康而已至关重要。功能性胃肠病()是由环境 、精神心理 、生理和社会因素相互作用而产生的一组功能性胃肠道疾病 。目前我们仍无法通过器质性疾病解释 的临床特征,认为它可能是由饮食、运动障碍、胃肠道动力失调、肠道菌群失调、内脏高敏感、黏膜免疫功能紊乱、中枢神经系统功能改变等众多因素交互作用,从而产生了各类临床症
5、状 。但越来越多的研究开始发现 的确存在一些器质性的改变,新的罗马标准重新定义它为一种脑 肠相互作用、脑肠互动障碍的疾病 。肠道菌群作为脑 肠互动的重要环节 ,其与 发生、发展存在密切联系,菌群干预 治疗 也被越来越多的学者们重视。根据中医理论,体质是人体在先天遗传影响和后天获得的基础上发育形成的相对稳定特征。其中除了平和质外,其他 种体质都属于偏颇体质 。人体是一个有机整体,各脏腑组织间及其与外界环境之间始终保持着即对立又统一的相对动态平衡状态,从而维持着机体的正常生命活动。这种平衡状态一旦遭到破坏又不能及时自我调节时机体就会生病 。肠道菌群作为寄生在人类肠道的“神秘器官”,与人类保持着互惠
6、互利的共生关系 ,一旦这种关系被破坏终将致病,故肠道菌群失调被认为是“万病之源”。而人体体质作为人类生命活动的一种重要形式,受先天以及后天的共同作用,与疾病和健康也有着密切关系,体质偏颇被指为“百病之因”。既然肠道菌群失调与体质偏颇都是人体健康和疾病的重要枢纽,那么通过在疾病中维持肠道微生态平衡和调节体质偏颇来维系健康、治愈疾病或许可以为很多疾病治疗提供新方向。阳虚质是指的人体因阳气不足,而以虚寒为主要特征表现的一种体质状态。其成因与天赋不足、养育不当等先天因素及个人习惯、生活环境、疾病影响等后天因素密切相 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 关,这与肠道菌群的结构及其稳定性与遗传
7、因素、饮食结构、生活环境、身体健康状况等多种因素密切相关的特点如出一辙。而且阳虚质发病易倾向于精神 食欲不振、腹泻、完谷不化、大便糖稀、腹部胀痛等病症,与功能性胃肠病患者病症相差无几。目前在国内外少有将功能性胃肠病与体质辨识、肠道菌群联系起来做回顾性研究。故而本文初步探索阳虚型体质功能性胃肠病患者与平和型健康者的菌群差异性,为功能性胃肠病的中医中药治疗提供客观依据。将中医体质理论和现代肠道微生态理念结合起来为中西医结合“精准”治未病的未来研究提供部分参考。对象与方法 对象按照实验纳入与排除标准筛选 例志愿者作为受试对象 。例均符合以下条件。纳入标准:年龄为 岁,不限性别;正常(),营养状态良好
8、;住惠州半年以上,生活习惯良好,月内保持日常饮食 饮食幅度变化不大;志愿者在开始实验的一个月内无发生任何疾病,实验期间无饮用酸奶、益生菌制剂,无使用抗生素等可能影响肠道菌群的药物或接受其他治疗的情况;个月内未参与其他实验研究,采样全程符合医院伦理委员会要求。其中 阳虚质患者纳入需半年以上有反复腹胀 腹痛 便秘 腹泻 餐后饱胀 早饱感 腹部烧灼感等腹部不适症状,伴有或不伴有恶心、嗳气、呕吐等,经“中医体质辨识量表”评估及中医科门诊诊查后符合阳虚型体质;健康人平和质纳入需半年以上无反复腹胀 腹痛 便秘 腹泻 餐后饱胀 早饱感 腹部烧灼感等腹部不适症状,伴有或不伴有恶心、嗳气、呕吐等,经“中医体质辨
9、识量表”评估及中医科门诊诊查后符合平和质型体质。排除标准:其他中医证候者;具有严重胃肠道疾病者:炎症性肠病、肠易激综合征、慢性腹泻或便秘、胃肠道恶性肿瘤等;有重大手术史者(如胃肠切除术 肠道狭窄 梗阻 穿孔 癌变倾向者);存在活动性感染:如肝炎病毒、病毒、感染等;近 个月内曾去过疫区;不洁性行为、使用违禁药物;妊娠及哺乳期妇女、烟酒嗜好者、对多种药物过敏 过敏体质者;近 个月内曾使用抗菌药物、质子泵抑制剂,服用益生菌、益生元、合生元制剂等;家族性自身免疫性疾病(如炎症性肠病、型糖尿病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎(桥本病)、毒性弥漫性甲状腺肿(病)、类风湿关节炎等)近期使用过免疫抑制剂或化学药物。本
10、实验在开始前已通过惠州市第一人民医院伦理委员会审查、批准,受试者在参与实验前均已阅读并签署实验知情同意书。方法实验仪器:低温冰箱、低温冰箱、低温冰箱、电子天平 、移液器、高压灭菌锅、低温高速离心机 、涡旋混合器 、凝胶成像系统、电泳仪 。实验试剂:、氯仿 异戊醇()、酚 氯仿 异戊醇()、异丙醇、无水乙醇、引 物、凝 胶 回 收 试 剂 盒、(溴化乙锭)、西班牙琼脂糖、。实验过程及取材:按照实验纳入与排除标准筛选志愿者共 例,记录志愿者的一般情况,主要包括姓名、年龄、性别、身高、体重、联系电话及收集标本日期。对于符合实验要求的志愿者,收集其粪便标本。采集步骤由专人统一规范讲解,具体步骤如下:排
11、便前先解干净小便,避免尿液污染标本;排便至干净的盒子里,采集标本前先清洁双手,用统一发放的无菌粪便取样器截取样本中段里部新鲜粪便样本 左右浸泡在装有细胞保存液的试管中,采集标本后在 小时之内交给实验负责人,在 小时之内储存在 超低温冰箱中保存。本实验主要为回顾性研究,根据实验纳入与排除标准分为实验组阳虚型功能性胃肠病患者(组)及健康组平和质健康人(组)。受试者要求生活习惯良好,月内保持日常饮食 饮食幅度变化不大;在开始实验的一个月内无发生任何疾病,实验期间无饮用酸奶、益生菌制剂,无使用抗生素等可能影响肠道菌群的药物或接受其他治疗的情况;经“中医体质辨识量表”评估及中医科主任门诊诊查后符合体质类
12、型。将收集的标本进行 测序:提取粪便标本总 、文库构建(扩增)、扩增产物回收、文库浓度和大小检测、上机测序,最后进行微生物信息数据的获取。微生物数据分析对所得数据主要进行 多样性分析、多样性分析及肠道菌群群落结构组成及差异性分析。首先利用 软件计算样品的 多样性指数的值,并做出相应的稀释曲线。再用 通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异进行 多样性()分析,检验不同标本的物种多样性差异。最后用 统计软件分析数据。对数据进行正态性及方差齐性检验,若两组间符合正态分布且方差齐,采用配对样本 检验;若不符合正态分布则使用非参数检验,其中 为差异有统计学意义,为差异有显著统计学意义。计量资料
13、若符合正态分布用均数 标准差(珋 )表示,若不符合正态分布资料则用中位数(四分位数间距)()表示,计数资料用百分数表示。结果 受试者一般资料本次课题实验共招募 名志愿者,其中排除 名志愿者的不合格标本(标本污染),共纳入 名志愿者。受试对象基本信息如下表 所示。现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 表 受试对象基本资料受试对象基本情况 年龄(岁)性别(男 女)身高()体重()注:正态分布计量资料以均值 标准差(珋 )表示。高通量测序基本数据本研究选取来自 (阳虚患者)、(平和质健康人)两组,个志愿者共 份粪便标本,提取其总 后采用 测序平台进行测序获得的 ,不同样本对应的 数量差距较
14、大,为避免样品数据大小不同对分析时产生偏差,我们将样品的测序深度尽可能提升后,再对每个样品进行随机抽平处理。如果测序深度用 多样性指数来衡量,指数是指实际测检的 数量,指数则是用于估算样品 的总数。分析得出结果如下图 所示。从图 的稀释曲线中可以看出,随着测序条数的增加,的数目从迅速增加到逐渐趋于平缓,在测序量增加到一定数目后,继续增加测序数量并不能发现更多新的物种,表明了本次样本序列量充分,已经达到足够的深度。图 样品物种丰富度 指数稀释曲线图注:横坐标指的是某样品中随机抽的 数目,纵坐标则是某样品的物种多样性();图中每一条曲线代表一个样品,随着测序深度的增加,当曲线趋于平缓时表示此时的测
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