一种新型黏度和硫化氢荧光探针的制备及应用.pdf
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1、一种新型黏度和硫化氢荧光探针的制备及应用杜宇婷*,潘彩霞(忻州师范学院化学系,山西忻州034000)摘要:黏度是一个重要的微环境参数,同时硫化氢(H2S)也是一种重要的气体分子,这两者都会参与和影响许多生理和病理过程.因此,对细胞内黏度和 H2S 浓度变化的检测具有实际意义.设计合成了荧光探针Mito-ANP,实现了同时检测体系内黏度和 H2S.当体系的黏度增加时,探针 Mito-ANP 的旋转被禁止,从而释放出红色的荧光.而加入 H2S 后,探针 Mito-ANP 的双键与 H2S 发生亲核加成反应释放出绿色荧光.探针 Mito-ANP 与硫化氢(H2S)和黏度呈良好的线性关系,并且对 H2
2、S 具有专一的选择性.此外,探针 Mito-ANP 还能成功地用于神经细胞中硫化氢和黏度变化的荧光成像.关键词:荧光探针;黏度;硫化氢;双响应中图分类号:O657.7文献标志码:A文章编号:02587971(2023)04092008硫化氢(H2S)是一种重要的生理气体分子1.许多证据表明,H2S 与一些疾病相关如炎症和癌症等相关2-3,并且它被公认为可以调节广泛的生理过程比如血管扩张、血管生成、细胞凋亡和和神经调节等4-8.在生物学上,H2S 与某些细胞器有关如线粒体9-10,线粒体内的 H2S 已被证实在氧化应激和细胞死亡中具有保护作用11-13.另外,细胞内的黏度是一个重要的微环境参数,
3、在维持细胞内最基本的信号中发挥重要的作用14.更加重要的是,H2S 水平的异常和黏度改变两者都与阿尔茨海默病(AD)和帕金森疾病有关15-18.因此,开发一种有效的检测工具同时监测细胞内 H2S 和黏度对阿尔茨海默病(AD)和帕金森疾病的探究和诊断具有重要意义.在众多分析方法中,荧光探针技术被认为是最有发展前途的生物传感技术,因为它能够实现原位实时监测,具有极好的的生物相容性和实现高空间和时间分辨率等19-24.荧光探针能够广泛用于检测细胞内和动物体内离子、代谢物和生物分子等25-27.目前,大多数荧光探针已被广泛应用于检测特定的分析物,但是它们很难做到同时检测多种生物分子28-32.近年来,
4、虽然已经报道了一系列的荧光探针响应 H2S33-38或者黏度39-40,但是能够同时检测黏度和硫化氢的探针很少.因此,迫切需要设计一种用于多种生物分子检测的荧光探针.Zhao 等412018 年报道了一种基于荧光团氟硼吡咯的双功能荧光探针,能够同时响应细胞内黏度的增加和 H2S的浓度变化.另外,Li 等42报道了一个能够靶向黏度和 H2S 的双功能荧光探针.这些双功能荧光探针检测 H2S 的机理主要是探针分子中叠氮化物被还原,从而造成了荧光出现的现象.然而,这些探针是被紫外光激发,并且叠氮化物会被紫外光分解,使得探针可能会产生错误的信号.因此,发展一种稳定性高的新型双功能荧光探针同时检测黏度和
5、H2S 很有必要.在本工作中,我们设计合成了一个可以同时响应黏度和 H2S 的探针 Mito-ANP,该探针以 9-蒽甲醛作为荧光团.如图 1 所示,由于在低黏度下,单键可以自由旋转,因此,探针分子的荧光可以忽略不计.随着体系黏度的增加,探针分子的转动受到限制,Mito-ANP 的荧光强度在 620nm 处显著增加.同时,探针分子 Mito-ANP 中吡啶盐有很强的吸电子能力,可以与亲核试剂 H2S 发生亲核加成反应40,探针的共轭体系从而被破坏,使得 Mito-ANP 的荧收稿日期:2022-11-03;接受日期:2023-01-17;网络出版日期:2023-03-22基金项目:山西省自然科
6、学基金(202203021212184);忻州师范学院 2021 年大学生创新创业训练项目(56);山西省 1331 工程优势特色学科化学建设项目(201964).*通信作者:杜宇婷(1990),女,山西人,博士,讲师,主要从事有机小分子荧光探针方向工作.E-mail:.云南大学学报(自然科学版),2023,45(4):920927JournalofYunnanUniversity:NaturalSciencesEditionDOI:10.7540/j.ynu.20220584光发射波长从 620nm 蓝移到 568nm,实现了探针对黏度和 H2S 的同时响应.另外,Mito-ANP 对H2S
7、 有很好的选择性和灵敏度,它对 H2S 的最低检测限仅为 12.89nmol/L.Mito-ANP 还能用于神经细胞中硫化氢和黏度变化的荧光成像.1实验部分1.1试剂与仪器4-甲基吡啶、2-溴乙醇、9-蒽甲醛购自安耐吉化学剂有限公司;六氢吡啶购自上海泰坦科技有限公司;二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯和石油醚均购自天津欧博凯化工有限公司;三氯甲烷从成都市科隆化学品有限公司购进.0.0540.077mm(200300 目)柱层析硅胶(青岛海洋化工公司).所用试剂均为分析纯,使用时无需进一步的纯化.所用去离子水(18Mcm)由Milli-Q纯化系统制备.DF-101S 型集热式恒温磁力搅拌器(巩义市予华
8、仪器有限责任公司);KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司);RE-2000B 旋转蒸发器;循环水真空泵;FS5 荧光光谱仪(英国爱丁堡公司);UV-2550 型紫外可见分光光度计(赛默飞公司);BrukerAVANCE-400MHz超导核磁共振波谱仪(德国);布鲁克高分辨质谱仪.1.2探针 Mito-ANP 的合成称取 4-甲基吡啶(0.8g)置于圆底烧瓶中,在搅拌状态下缓慢加入 2-溴乙醇(0.61mL)(分子比为 11),在 70 下反应 24h 左右,TLC 跟踪反应(V乙酸乙酯:V石油醚=15).待反应完成后,用无水乙醇洗涤固体,并且用超声震碎固体
9、,固体溶解.悬干溶剂后,将得到的果冻状液体置于冷冻液中,直至析出固体,得到1.7g 化合物 1,产率为 87%.称取 0.5g化合物 1 置于圆底烧瓶中,加入适量三氯甲烷,超声震碎溶解,溶液呈白色浑浊液.然后加入 67 滴六氢吡啶搅拌均匀后,再往溶液体系中缓慢加入 9-蒽甲醛(0.51g)(分子比为 11),在 70 下回流.溶液颜色变黄,回流 10min 左右,体系颜色逐渐加深至暗红色.反应 24h 左右,TLC跟踪反应(V乙酸乙酯:V石油醚=15).待反应完成后,悬干溶剂,用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥得到 0.85g探针分子 Mito-ANP,产率为 84%.1HNMR(400MHz,DMS
10、O-d6):9.04(d,J=4Hz,1H),8.99(d,J=12Hz,2H),8.72(s,1H),8.56(d,J=4Hz,2H),8.39(d,J=8Hz,2H),8.18(d,J=8Hz,2H),7.61(m,4H),7.36(d,J=12Hz,1H),5.31(t,J=4,8Hz,1H),4.67(t,J=4,8Hz,2H),3.92(d,J=4Hz,2H);13CNMR(100 MHz,DMSO-d6):152.7,145.4,138.1,132.6,131.4,130.5,129.5,129.4,128.9,127.2,126.1,125.8,124.6,62.7,60.7.M
11、S(C23H20NO)m/z 实测值(计算值):326.1527M.探针 Mito-ANP 的合成路线见图 2.图2探针 Mito-ANP 的合成路线Fig.2SyntheticrouteoftheprobeMito-ANP1.3荧光探针 Mito-ANP 对黏度的光谱特性探针 Mito-ANP 用二甲基亚砜(DMSO)溶解,并且配置成 10mmol/L 的母液.不同黏度的液体使用磷酸缓冲液(PBS,pH=7.4)与甘油不同的比例制得.在测定荧光光谱时,将探针 Mito-ANP 的浓度稀释至5mol/L,在不同体积比例 PBS 和甘油混合溶液中测试荧光发射强度.激发波长和发射波长的狭缝宽度都设
12、置为 5nm.探究探针的荧光发射强度和溶液黏度的关系遵循福斯特方程43:LogIf=c+xLog,其中 If为荧光强度,为黏度,x 和 c 是常数.1.4荧光探针 Mito-ANP 对硫化氢(H2S)的光谱特性硫化钠(Na2S9H2O)用二蒸水稀释,配制成 100mmol/L 的母液作为硫化氢(Na2S)的来源.在测定荧光光谱时,把一定量的 Na2S 和其他分析物加入到探针溶液中.测试时,将探针 Mito-ANP的浓度稀释至 5mol/L,所有的光谱测试都在CH3CN/PBS 的缓冲溶液中进行(VCH3CNVPBS=11,10mmol/L,pH=7.4).探究探针 Mito-ANP 对不同氨基
13、酸如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、图1双功能荧光探针 Mito-ANP 对黏度和 H2S 的设计机理Fig.1Rational design of a dual-function fluorescent probeMito-ANPforviscosityandhydrogensulfide第45卷杜宇婷等:一种新型黏度和硫化氢荧光探针的制备及应用921谷 胱 甘 肽(GSH)、赖 氨 酸(Lysine)、色 氨 酸(Tryptophan)、苏 氨 酸(Threonine)以 及 核 苷 酸(Nucleotide),维生素如维生素 C(VitaminC)、维生素 D(VitaminD
14、),和各种阴离子如 Br、CI、SO42、SO32、NO3、NO2的选择性实验时,将这些分析物用二蒸水配置成终浓度为 1mmol/L 的母液.激发波长和发射波长的狭缝宽度都设置为 5nm.2结果与讨论2.1探针 Mito-ANP 对黏度的光谱响应如图 3(a),当体系的黏度从 1.03103Pas(100%PBS)增加到902.52103Pas(90%甘油)时,探针 Mito-ANP 分子内扭曲转移电荷被限制,使得探针在 620nm 处随着黏度的增加,荧光强度逐渐增强,最大增强了8.5 倍左右.值得注意的是,如图 3(b),在黏度为1.03103954.52103Pas 的范围内,根据福斯特方
15、程(LogIf=c+xLog),探针荧光强度的对数与黏度对数呈良好的线性关系,线性公式为 y=0.105x+3.73,线性关系数 R2=0.993.另外,在不同溶剂中,探针的荧光发射强度也不同.如图 3(c)所示,在二甲基亚砜(DMSO)、甲醇,乙醇、乙腈、PBS 和甘油中,Mito-ANP 的荧光强度增强仅在甘油中有显著的增强,而在其他溶剂中只有微弱的变化,这主要是归因于甘油的高黏度.以上数据说明,Mito-ANP对黏度有很好的响应.2.2探针分子 Mito-ANP 在不同溶剂中的绝对荧光量子产率如表 1 所示,探针 Mito-ANP 在乙腈极性溶剂中的绝对荧光量子产率最高,因此选择乙腈作为
16、测试探针响应硫化氢(H2S)的溶剂.2.3探针分子 Mito-ANP 对 H2S 的光谱响应如图 4(a)所 示,在 CH3CN/PBS 的 缓 冲 溶 液 中(VCH3CNVPBS=11,10mmol/L,pH=7.4),随着不同浓度 Na2S 的加入,探针 Mito-ANP 的荧光强度在 568nm 处的荧光强度逐渐增强,说明探针 Mito-ANP 对 H2S 有很好的响应.同时,如图 4(b)所示,在 025mol/L范围内,探针的荧光强度与 Na2S的浓度呈良好的线性关系,其线性公式为y=618.13x+6150.31,R2=0.994).根据 LOD=3Sb/k公式计算得到探针 Mi
17、to-ANP 对 H2S 的最低检测限仅为 12.89nmol/L.2.4探针 Mito-ANP 对 H2S 的反应选择性和 pH依赖性探针的选择性和 pH 依赖性是评价探针在生理条件下准确检测 H2S 的前提.因此,我们测试了探针 Mito-ANP 对 H2S 的选择性和 pH 依赖性.如图 5(a)所示,只有加入 Na2S 才能引起探针的荧光强度增加,而其他氨基酸(如 Cys,Hcy,GSH,Lysine,Tryptophan,Threonine),以及核苷酸(Nuc-leotide),维生素(如 VitaminC,VitaminD)和其他阴离子(如 Br、CI、SO42、SO32、NO3
18、、NO2)的加入只能引起探针荧光强度的微弱变化.在 pH 测图3探针 Mito-ANP 在不同体积比 PBS-甘油溶液中黏度响应的荧光光谱、线性曲线及在不同溶剂中的荧光光谱Fig.3Fluorescent spectra of Mito-ANP for viscosity indifferentvolumeratiosPBS-glycerolsolution,lineargraphandfluorescentspectraofMito-ANPindifferentsolvents922云南大学学报(自然科学版)http:/第45卷试中,Mito-ANP 在 pH 值为 410 的范围内,荧光强
19、度在 568nm 处稳定性很好,不受酸碱体系的影响,见图 5(b).当加入 Na2S 后,随着 pH 值的增加,探针的荧光强度在 568nm 处明显增强,这是由于Na2S 在碱性环境中具有较高的亲核性.上述结果表明,探针 Mito-ANP 对 H2S 有专一的选择性和良好的 pH 耐受性.2.5探针分子 Mito-ANP 对 H2S 检测的识别机理研究为了进一步验证推测的机理(图 1),即探针Mito-ANP 与 Na2S 发生亲核加成反应 图 6(a),我们利用高分辨质谱滴定实验验证.如图 6(b)所示,特征峰m/z 为360.14166,这是归因于(Mito-ANP)+SH 的分子离子峰,
20、与之前文章报道的反应机理相类似40.以上结果说明,探针 Mito-ANP 与 Na2S 发生亲核加成反应.2.6探针分子 Mito-ANP 在帕金森疾病疾病模型中的应用帕金森病是一种慢性神经退行性疾病,与生物硫醇如还原型谷胱甘肽(GSH),半胱氨酸(Cys)和高半胱氨(Hcy)水平密切相关44-45,这些生物硫醇在细胞内可以被代谢产生硫化氢46.为了探究探针 Mito-ANP 在帕金森疾病模型中的应用,我们首先用 6-羟基多巴胺(6-OHDA)处理神经细胞 PC12 建立帕金森病细胞模型.结果如图 7 所示,当 PC12 细胞与探针 Mito-ANP(10mol/L)共孵育时,细胞在绿色通道有
21、较强的荧光.然而,PC12 细胞被 6-OHDA 预处理后,绿色通道荧光强度下降显著并且伴随部分细胞死亡.这个结果表明帕金森症的病理生理和病理过程与硫化氢的消耗表1不同溶剂中绝对荧光量子产率的对比Tab.1A comparison of the absolute fluorescent quantumyieldindifferentsolvents溶剂绝对荧光量子产率/%溶剂绝对荧光量子产率/%乙腈6.20乙酸乙酯0.60二甲基亚砜2.94四氢呋喃0.49甲醇1.35图4探针 Mito-ANP 在测试体系中的荧光光谱和线性曲线Fig.4FluorescentspectraofMito-ANPi
22、ntestsystemandlineargraph图5探针 Mito-ANP 在测试体系中的选择性荧光柱状图和 pH 响应Fig.5ThefluorescentintensityofMito-ANPwithNa2SandotheranalytesintestsystemandpHresponse第45卷杜宇婷等:一种新型黏度和硫化氢荧光探针的制备及应用923密切相关.接下来,我们研究了 Mito-ANP 对 PC12 细胞黏度的响应.制霉菌素可通过破坏子平衡,诱发线粒体结构改变,从而导致线粒体黏度明显增加47.结果如图 8 所示,当 PC12 细胞与探针 Mito-ANP(10mol/L)共孵
23、育时,细胞在红色通道有微弱的图6探针 Mito-ANP 对 H2S 的响应机制和反应前的高分辨质谱图Fig.6TheproposedresponsemechanismofMito-ANPtowardsH2SandHRMSspectraofMito-ANPbeforereactionPC12 细胞用 6-OHDA 预处理 12h 后,再孵育 Mito-ANP30min(标尺:50m).图7Mito-ANP 在帕金森疾病模型中的应用Fig.7ApplicationofMito-ANPinParkinsonsdiseasemodelPC12 细胞用制霉菌素预处理 10h 后,再孵育 Mito-ANP
24、30min(标尺:50m).图8Mito-ANP 对 PC12 细胞黏度的响应Fig.8ResponseofMito-ANPtoPC12cellviscosity924云南大学学报(自然科学版)http:/第45卷荧光.当 PC12 细胞被制霉菌素预处理后,红色通道荧光强度显著增强.这个结果表明 Mito-ANP 可以特异性地检测线粒体黏度.3结论本文设计合成了一个同时靶向黏度和 H2S 的荧光探针 Mito-ANP.随着体系黏度的增加,探针Mito-ANP 分子内扭曲转移电荷被限制,荧光强度从而逐渐增强.另外,探针 Mito-ANP 还能够与H2S 发生亲核加成反应,它对 H2S 的最低检测
25、限仅为 12.89nmol/L,说明该探针对 H2S 检测的灵敏度很高.同时,探针对 H2S 也具有很好的选择性.更重要的是,探针 Mito-ANP 还能成功地用于神经细胞中硫化氢和黏度变化的荧光成像.这项工作提供了一种新型荧光探针,它能够靶向黏度和 H2S,也为早期发现阿尔兹海默疾病提供了一种可能方法.参考文献:FilipovicMR,ZivanovicJ,AlvarezB,etal.Chemicalbiology of H2S signaling through persulfidationJ.ChemRev,2018,118(3):1253-1337.DOI:10.1021/acs.ch
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