DB33∕T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 22472020 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 - 03 - 03 发布 2020 - 04 - 03 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 22472020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲
2、料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人:云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。 DB33/T 22472020 1 鸭坦布苏病毒 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。 2 术语和定义 2.1 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTM
3、UV) 属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群,可引起鸭、鹅产蛋下降,雏鸭、雏鹅发病死亡。 3 实验条件 3.1 主要仪器设备 3.1.1 PCR 仪。 3.1.2 荧光定量 PCR 仪。 3.1.3 微量移液器。 3.1.4 组织匀浆器。 3.1.5 电泳仪。 3.1.6 电泳槽。 3.1.7 水浴锅。 3.1.8 紫外凝胶成像系统。 3.1.9 高速台式低温离心机。 3.1.10 生物安全柜。 3.2 试剂 3.2.1 0.01M 磷酸盐缓冲液 (0.01 mol/L, pH7.4 PBS) : 称取 8.0 g NaCl、 0.2 g KCl、 2.9 g Na2HPO41
4、2H2O、0.2 g KH2PO4,将上述试剂溶于 800 mL 去离子水中,充分搅拌溶解,滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4,然后加去离子水定容至 1 L,高温灭菌 30 min,室温保存。 3.2.2 氯仿。 3.2.3 异丙醇。 3.2.4 焦炭酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌去离子水:用 DEPC 50 L,加超纯水至 100 mL,室温过夜,121高压灭菌 15 min,分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管,冻存备用。 3.2.5 75%乙醇:取新开启的无水乙醇 75 mL,加 DEPC 水至 100 mL,混匀,-20预冷。 DB33/T 22472020 2 3.2.6
5、溴化乙锭 (EB):取 1.0 g 溴化乙锭,加去离子水,定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存,其工作浓度为 0.5 g /mL。 3.2.7 1 TAE 缓冲液:取 242 g 羟基甲基氨基甲烷(Tris)、37.2 g 二水乙二铵四乙酸二钠、57.1 mL冰乙酸,加去离子水定容至 1 L,配置成 50 TAE 电泳缓冲液;量取 20 mL 的 50 TAE 电泳缓冲液,加入去离子水定容至 1 L,室温保存。 3.2.8 1%琼脂糖凝胶:称取 1.0 g 琼脂糖,加入 1 TAE 电泳缓冲液 100 mL,轻轻混匀后加热,使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至
6、5060时,加 EB 溶液(终浓度 0.5 g/mL)或 5 L 核酸染料,摇匀后倒入制胶板中,厚度为 3 mm5 mm,室温凝固后取下电泳梳子,备用。 3.2.9 DNA 相对分子质量标准物 Marker:DL 2000。 3.2.10 10 加样缓冲液:称取 25 g 聚蔗糖、0.1 g 溴酚蓝、0.1 g 二甲苯青,加入灭菌双蒸水定容至100 mL。 3.2.11 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂盒。One Step Prime Script RT-PCR Kit(Perfect Real Time,TAKARA),含有 RT-PCR 缓冲液,酶混合物,dNTP 混合物,无
7、 RNA 酶的水等。 3.2.12 M-MLV 反转录酶。 3.2.13 RNA 酶抑制剂。 3.2.14 TaqDNA 聚合酶。 3.2.15 dNTPs。 3.2.16 引物:RT-PCR 扩增引物,见表 1;实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针,见表 2。 表1 RT-PCR 扩增引物 引物名称 引物序列 DTMUV引物P1 5- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3 DTMUV引物P2 5- AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3 表2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针 引物名称 引物序列(5-3) DTMUV 引物 P3 AAGTCAGGCCA
8、GGGAATCC DTMUV 引物 P4 CATGCACCCAGATTTGTTAACC DTMUV探针 FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 4 操作步骤与结果判定 4.1 样品采集与处理 4.1.1 组织器官 5.1.1.1 用无菌镊子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官(肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等),装入一次性塑料袋或其它灭菌容器,编号。 5.1.1.2 取待检组织样品适量(0.1g),按1:5 倍(W/W)加入无菌 0.1M PH 7.4 PBS,于灭菌并烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨,反复冻融2次后,4 ,3000 r/min 离心5 min,取上清1 mL转至无菌的
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