小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 982小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析王杨铭1,2,王晓琼2,郑贝贝2,韩玲玲3,刘松涛2*,张亚菲2,许海霞1,程西永1*(1河南农业大学农学院,河南郑州450002;2河南农业职业学院,河南郑州451450;3河南秋乐种业科技股份有限公司,河南郑州450002)摘要:【目的】克隆小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(CIPK)TaCIPK15基因,并分析该基因编码的蛋白与小麦钙调素B类似蛋白(TaCBLs)的互作关系,为深入研究TaCIPK15基因在小麦逆境胁迫应答机制中的作用提供参考。【方法】通过PCR扩增小麦TaCIPK15基因编码区(CD
2、S)全长序列,对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究其对逆境的响应,通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术研究TaCIPK15与TaCBLs的互作关系。【结果】克隆获得的小麦TaCIPK15基因CDS序列全长1302 bp,编码433个氨基酸残基,与NCBI数据库中参考序列XR_006454427.1相似性为100%,蛋白分子量为48.48 kD,原子总数为6896,分子式为C2166H3487N599O628S16,理论等电点(pI)为9.38,不具备跨膜结构和信号肽。TaCIPK15蛋白含有CIPK家族保守NAF结构域和激活环,与大麦HvCIPK15(XP_0
3、44946251)氨基酸序列最为相似且亲缘关系最近。盐胁迫(NaC1)下TaCIPK15基因呈下调表达趋势;在冷胁迫(4)下,根系中TaCIPK15基因上调表达;脱落酸(ABA)处理后,根系和叶片中12 h的表达量均上调。TaCIPK15与TaCBL1和TaCBL2在酵母双杂交试验中能在四缺培养基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-gal/ABA上长出蓝色菌斑;在双分子荧光互补试验中,TaCIPK15与TaCBL1在细胞核上检测到黄色荧光,TaCIPK15与TaCBL2在细胞质和细胞膜上检测到黄色荧光。【结论】TaCIPK15基因属于CIPK家族,TaCIPK15与TaCBL1和
4、TaCBL2存在互作关系且在细胞内的互作位置不同,并在小麦响应高盐胁迫、冷胁迫和ABA胁迫的Ca2信号转导过程中发挥作用。关键词:小麦;TaCIPK15;基因克隆;互作蛋白中图分类号:S512.1文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)04-0982-11收稿日期:2023-01-29基金项目:河南省自然科学基金项目(202300410217);河南省重大科技专项(221100110300)通讯作者:刘松涛(1971-),https:/orcid.org/0009-0008-8649-9928,教授,主要从事农作物栽培与育种研究工作,E-mail:;程西永(1972-),http
5、s:/orcid.org/0009-0009-8762-8565,副教授,主要从事小麦遗传育种研究工作,E-mail:第一作者:王杨铭(1990-),https:/orcid.org/0000-0002-1496-6813,主要从事作物遗传育种研究工作,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(4):982-992ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.002Cloning of TaCIPK15 gene and interacti
6、on analysis withTaCBLs protein in wheatWANG Yang-ming1,2,WANG Xiao-qiong2,ZHENG Bei-bei2,HAN Ling-ling3,LIU Song-tao2*,ZHANG Ya-fei2,XU Hai-xia1,CHENG Xi-yong1*(1HenanAgricultural University,Zhengzhou,Henan 450002,China;2Henan Vocational College ofAgriculture,Zhengzhou,Henan 451450,China;3Henan Qiul
7、e Seeds Technolygy,Co.,Ltd.,Zhengzhou,Henan 450002,China)Abstract:【Objective】The purpose of the study was to clone the wheat serine/threonine protein kinases(CIPK)TaCIPK15 gene and analyze the interaction between the protein encoded by TaCIPK15 gene and wheat calcineurin B-likeprotein(TaCBLs),so as
8、to provide reference for the in-depth study of the function of TaCIPK15 gene in the mechanismof response to adversity stress in wheat.【Method】The full length of coding region sequence(CDS)of wheat TaCIPK15gene was amplified by PCR and analyzed by bioinformatics methods.The real-time fluorescence qua
9、ntitative PCR(qRT-PCR)method was used to study its response to adversity,and the interaction between TaCIPK15 and TaCBLs was studiedby yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation techniques.【Result】The CDS sequence of wheatTaCIPK15 gene obtained by cloning was 1302 bp in length,enc
10、oding 433 amino acid residues,which was 100%similarwith the reference sequence XR_006454427.1 in the NCBI database.TaCIPK15 protein had a molecular weight of 48.48 kD,4期9830引言【研究意义】小麦(Triticum aestivum L.)是我国乃至世界重要的粮食作物,是全世界1/3以上人口的主食。在小麦生长发育过程中,时常面临干旱、盐渍、低温、高温等不良环境,严重影响小麦正常的生长发育,造成小麦产量降低或品质下降(Gupta
11、 etal.,2020)。研究小麦对逆境的响应机理,有助于提升小麦对于逆境胁迫的抗性,增强小麦的稳产性,有利于培育高产、优质、抗逆性强的小麦新品种,对保障我国粮食安全有着重要作用(李海泳和殷贵鸿,2022)。Ca2+是植物生长发育过程中必不可少的一种大量元素,并作为重要的第二信使参与多种调节植物逆境响应的过程(Yin et al.,2017;Kudla et al.,2018;Kster et al.,2019;吴春婷等,2022)。钙调素B类似蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)作为Ca2+传感器,通过与一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CIPK(CBL intera
12、cting protein kinase)相互作用而形成一套Ca2+信号转导系统CBL-CIPK信号系统,在盐、干旱、寒冷、低钾等非生物逆境的应答机制中起 着 重 要 作 用(Kolukisaoglu et al.,2004;Luan,2009;Tang et al.,2020)。在CBL-CIPK信号系统中,CBL蛋白是Ca2+信号响应蛋白,与Ca2+结合形成Ca2+-CBL复合物,但CBL蛋白本身无激酶活性,必须与CIPK蛋白结合,激活CIPK蛋白激酶活性,启动相关的抗逆响应(谢玲玲等,2021)。因此,研究小麦CBL-CIPK信号系统及其功能,有利于探索小麦响应逆境胁迫机制。【前人研究进
13、展】CIPK家族具有N端保守激酶结构域和C端调节结构域,二者间存在1个连接结构域,C端结构域包含2个保守的相互作用域,即NAF结构域和PPI结构域,NAF结构域负责CBL-CIPK相互作用,相邻的PPI结构域可使CIPK与ABI1、ABI2等PP2C型蛋白磷酸酶进行互作(Weinland Kudla,2009;Kudla et al.,2010;程西永等,2018)。CIPK家族广泛存在于植物中。在拟南芥中发现了10个CBLs和26个CIPKs,其中AtCIPK24与AtCBL4相互作用,维持植物细胞内Na+和K+的动态平衡,提高植物抗盐性(Halfter et al.,2000);AtCIP
14、K23与AtCBL1、AtCBL9互作,可促进植物吸收K,也能通过参与脱落酸(ABA)信号通路调节气孔运动(Gei-ger et al.,2009;Ragel et al.,2015;Lara et al.,2020);AtCBL2/AtCBL3与AtCIPK2/AtCIPK3/AtCIPK2326形成多价相互作用网络,减轻Mg2+对植物的毒害(Gu et al.,2020);拟南芥AtCIPK6的缺失会导致植株发育缺陷,并对盐胁迫更加敏感(Tripathi et al.,2009);AtCIPK7与AtCBL1相互作用,在冷胁迫应答过程中起重要作用(Huang et al.,2011;黄聪琳
15、等,2013)。水稻中发现了31个OsCIPKs基因,目前关于水稻CIPK家族的功能已有较多报道,在响应生物胁迫和非生物胁迫过程中均起着关键作用(Weinl andKudla,2009)。基因表达分析表明,水稻OsCIPK1/OsCIPK2/OsCIPK10/OsCIPK11/OsCIPK12 在 感 染细菌性枯萎病后表达量均上调(Chen et al.,2011);OsCIPK29蛋白激酶能磷酸化修饰水稻条纹病毒的NS3蛋白,减弱病毒致病性(庄新建,2021);过表达OsCIPK3基因后能增强水稻的耐冷性,过表达Os-CIPK12基因使水稻更耐旱,过表达OsCIPK15基因可增强水稻的耐盐性
16、(Xiang et al.,2007);OsCIPK31蛋白激酶在水稻抗纹枯病和生长发育过程中发挥其功能(Piao et al.,2010;Peng et al.,2018;陈欢,2022)。大豆CIPK家族包含54个成员,在植物应对盐胁迫、干旱胁迫等过程中起着重要作用,其中GmCIPK9/GmCIPK12/GmCIPK24/GmCIPK49在干旱处理后表达量显著提高;大豆CIPK基因GmPKS4在盐碱胁迫下表达量上调,过表达该基因能提高大豆的耐盐性with a total number of atoms of 6896,a molecular formula of C2166H3487N59
17、9O628S16,and theoretical isoelectric point(pI)of 9.38.TaCIPK15 protein had no transmembrane structure and signal peptide.TaCIPK15 protein contained conservedNAF structural domain and activation loop of CIPK family,and the amino acid sequence was most similar and the closestrelative to that of barley
18、 HvCIPK15(XP_044946251).The expression of TaCIPK15 gene was down-regulated under saltstress(NaCl).The expression of TaCIPK15 gene was up-regulated in root under cold stress.The expression was up-regu-lated in root and leaf at 12 h after abscisic acid(ABA)treatment.TaCIPK15,TaCBL1 and TaCBL2 showed t
19、he ability togrowblueplaquesonfour-deficientmediaSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-gal/ABAinyeasttwo-hybridtest.Inthebimolecularfluorescence complementation test,TaCIPK15 and TaCBL1 detected yellow fluorescence in the nucleus,and TaCIPK15and TaCBL2 detected yellow fluorescence in the cytoplasm and cell membr
20、ane.【Conclusion】The TaCIPK15 gene belongsto CIPK gene family.TaCIPK15 interacts with TaCBL1 and TaCBL2 and has different interaction positions in cells.TaCIPK15 gene plays a role in Ca2+signaling transduction in wheat in response to high salt stress,cold stress and ABAstress.Key words:wheat;TaCIPK15
21、;gene cloning;interacting proteinsFoundation items:Henan Natural Science Foundation(202300410217);Henan Major Science and TechnologyProject(221100110300)王杨铭等:小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析54卷南 方 农 业 学 报 984(Zhu et al.,2016;Ketehouli et al.,2021)。小麦是异源六倍体作物,染色体组成较复杂,小麦中CIPK基因家族成员众多。研究人员通过数据库检索,从小麦基因组中
22、鉴定出24个TaCBL基因和79个TaCIPK基因(Sun et al.,2015),已有部分CIPK基因功能被研究,如小麦TaCIPK16在盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫和乙烯胁迫信号转导途径中发挥重要作用(马晶飞,2015);小麦TaCIPK3与TaCBL1/TaCBL2/TaCBL3/TaCBL4之间存在相互作用(程西永等,2018);小麦TaCIPK2能与TaCBL2互作,且TaCIPK2的表达受ABA、低温和盐胁迫的诱导(程西永等,2016)。【本研究切入点】小麦CIPK家族成员较多,但大多数TaCIPKs基因的生物学功能和互作调控通路尚不清晰,而TaCIPK15基因的相关研究尚未见报道
23、,克隆小麦TaCIPK15基因并研究其与TaCBLs的互作关系,有助于了解小麦对逆境响应的信号转导机制。【拟解决的关键问题】从普通六倍体小麦中克隆得到TaCIPK15基因,对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究其对逆境的应答,并利用酵母双杂交系统和双分子荧光互补系统检测TaCIPK15 与 TaCBLs 的 互 作 关 系,为 深 入 研 究TaCIPK15基因在小麦逆境胁迫应答机制中的作用提供参考。1材料与方法1.1试验材料供试材料六倍体普通小麦品种德抗961由河南农业大学小麦遗传育种研究室提供;酵母菌株Y187、Y2HGold及酵母载体pGBKT7、pGADT
24、7购自Clontech公司;双分子荧光互补载体pSAT4-cEYFP-C1-B与pSAT4-nEYFP-C1由河南农业大学小麦遗传育种研究室保存提供。主要试剂:RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司;RNA反转录试剂盒、感受态细胞制备试剂盒、pMD-19T和酵母双杂交SD培养基购自TAKARA公司;高保真酶KOD PlusNeo和T4 DNA聚合酶购自TOYOBO公司,DNA限制性内切酶购自Thermo Fisher公司;胶回收试剂盒、产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、氨苄青霉素、X-gal和ABA购自生工生物工程(上海)股份有限公司;Cellonlase R10和Macer
25、ozyme R10购自南京斯博慕生物科技有限公司,质粒大量提取试剂盒购自QIAGEN公司。1.2试验方法1.2.1样品处理挑选大小一致的饱满小麦种子,用70%乙醇进行消毒处理,置于光照培养箱内培养15 d,取幼嫩叶片提取小麦总RNA,采用反转录试剂盒合成cDNA第一链,保存于-20 冰箱。挑选大小一致的饱满拟南芥种子,消毒后于光照培养箱中培养,光照条件为12 h光照/12 h黑暗,23、相对湿度55%,光子通量密度75 E/(m2s),培养4周后用于原生质体提取。1.2.2基因克隆根据NCBI网站(https:/www.nc-bi.nlm.nih.gov/)中查询到的小麦TaCIPK15基因序
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