外周血中性粒细胞和口腔中性粒细胞免疫炎症反应的差异比较.pdf
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1、文章编号()外周血中性粒细胞和口腔中性粒细胞免疫炎症反应的差异比较朱沁,高岚青,仝悦,孙颖(南京医科大学附属口腔医院牙周病科,江苏省口腔疾病研究重点实验室,江苏省口腔转化医学工程研究中心,江苏 南京)摘要 目的:比较口腔中性粒细胞()和外周血中性粒细胞()免疫炎症反应的差异,探讨 维持牙周健康的作用。方法:常规密度梯度离心法分离获得健康人外周静脉血来源的,离心过滤法分离获得健康人口腔含漱液来源的。采用 牙龈卟啉单胞菌()脂多糖()刺激,并以大肠杆菌()作为阳性对照,流式细胞术检测凋亡水平变化;实验比较白介素()刺激前后两种细胞趋化能力的差异;检测、和 表达水平变化;流式细胞术检测两种细胞对 或
2、 的吞噬作用;免疫荧光实验观察中性粒细胞胞外诱捕网()的形成,法对胞外 进行定量;检测丝裂原活化蛋白激酶()、细胞外信号调节蛋白激酶()和核转录因子()磷酸化水平的变化。结果:两种 刺激后,与 相比,凋亡增多()。刺激后,两种细胞趋化能力未见明显差异()。两种 刺激后,较 的、和 表达水平更高()。吞噬 和 的能力强于(),形成的 更多,胞外 水平、和 磷酸化水平均较 更高()。结论:可能是具有过度活跃表型的中性粒细胞,其吞噬、分泌细胞因子和形成 的能力较 增强,可能与其、和 磷酸化水平增高有关。关键词 口腔中性粒细胞;外周血中性粒细胞;趋化;吞噬;中性粒细胞胞外诱捕网中图分类号 文献标识码
3、基金项目:国家自然科学基金();南京医科大学科技发展基金();江苏省科教能力提升工程 江苏省研究型医院(),江苏省医学创新中心()通信作者:孙颖,:,(,):,:()(),:,()()(),(),(),(),()():,()(),()(),():,口腔生物医学 年 月(第 卷第 期),;牙周炎是一种菌斑生物膜引起的慢性感染性疾病,牙龈卟啉单胞菌(,)是其主要的致病菌之一,脂多糖(,)是 重要的毒力因子之一。中性粒细胞是一种骨髓来源的先天免疫细胞,在牙周炎的发生发展中发挥重要作用,通过吞噬、生成活性氧(,)、分泌细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网(,)等方式参与免疫炎症反应。现有的大部分关于中性
4、粒细胞的体外研究均以外周血中性粒细胞(,)为研究对象。包括 在内的牙周致病菌入侵时,来自细菌本身和组织内巨噬细胞的信号启动中性粒细胞趋化,局部血管通透性增加,家族趋化因子配体(,)、等趋化因子释放。入侵牙周组织的致病菌可促进血管内皮细胞表达 选择素(),选择素与中性粒细胞表面的选择素配体结合,建立中性粒细胞和活化的内皮细胞之间的初始接触,中性粒细胞随后从内皮细胞层“挤”出、进入组织,顺趋化因子浓度梯度,向致病菌入侵部位迁移,并进一步经牙周袋内壁和口腔上皮迁移至口腔内,成为口腔中性粒细胞(,)。维持牙周组织稳态的作用是否与 相同,尚不得而知。本研究拟比较 和 凋亡、趋化、分泌细胞因子、吞噬和 形
5、成等多种免疫炎症反应的差异,探讨 在维持口腔及牙周健康方面的作用。材料与方法 主要试剂及仪器 和大肠杆菌(,)由南京医科大学江苏省口腔疾病研究重点实验室保种并提供。(,美国),、佛波酯(,)、人血清来源免疫球蛋白(,)(,美国),人白介素(,)(,美国),培养液、脑心浸液(,)培养基、肉汤(,)培养基(,美国),异硫氰酸荧光素(,)(,美国),细胞外信号调节蛋白激酶(,)、丝裂原活化蛋白激酶(,)、抗体(,美国),核转录因子(,)、抗体(,美国),甘油醛磷酸脱氢酶(,)抗体(,美国),兔抗人髓过氧化物酶(,)多抗、核酸染色剂(,美国),聚赖氨酸(北京中杉金桥),二脒基苯基吲哚二盐酸盐(,)(上
6、海碧云天),检测试剂盒(武汉华美)。流式细胞仪(,美国),正置荧光显微镜(,德国),多功能酶标仪(,德国),化学发光成像系统(,法国),图像分析软件(,美国)。方法 和 的分离本研究经南京医科大学附属口腔医院伦理委员会批准(伦理号:),所有纳入研究的志愿者均签署知情同意书。牙周健康者的纳入标准:全口探诊深度,无因牙周炎导致的附着丧失,全口探诊出血位点。排除标准:()妊娠期或哺乳期妇女;()个月内使用过抗生素、非甾体类抗炎药或免疫抑制剂;()个月内接受过牙周治疗;()吸烟;()患有血液病、糖尿病等系统性疾病、自身免疫性疾病或免疫缺陷;()患有冠周炎、急性尖周炎、急性龈乳头炎、急性牙周脓肿等口内急
7、性炎症。采集志愿者外周静脉血 ,常规密度梯度离心法分离获得。收集全身和牙周健康的志愿者口腔含漱液,收集前不进食、不饮水,无菌 溶液漱口 ,收集漱口液 ,相对离心力(,)离心,重悬后,依次通过、和 的无菌滤网,筛除上皮细胞和细胞碎片,离心,获得;获得的两种细胞均悬于 完全培养基。采用流式细胞技术鉴定细胞活性,迪夫染色鉴朱沁,等外周血中性粒细胞和口腔中性粒细胞免疫炎症反应的差异比较定细胞纯度,所获得 纯度和活性均大于,纯度大于 且活性大于,可用于后续实验。中性粒细胞凋亡的流式细胞学检测将两种中性粒细胞以 个 孔接种于 孔板,分为 组:阴性对照组(不加刺激)、组(刺激)和 组(刺激)。后,收集细胞,
8、加入 和 碘化丙锭溶液,避光孵育 ,采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。中性粒细胞对 的趋化能力检测将两种中性粒细胞以 个 孔接种于 孔 小室的上室,下室置入 空白培养液(对照组)或含 的 培养液(刺激组),每组 复孔。孵育 后,多聚甲醛固定 ,结晶紫染色 ,正置荧光显微镜下,拍照并计算 个随机视野内的中性粒细胞个数。、和 分泌水平的 检测两种中性粒细胞的分组同,后,收集细胞培养液上清液,按照、和 试剂盒说明书操作,采用多功能酶标仪检测 波长下光密度值。中性粒细胞吞噬 的功能检测 接种于 固体培养基,后转至 液体培养基;接种于 固体培养基,后转至 液体培养基;分别增菌后灭活,备用。将菌液与 探针混
9、合,避光孵育 。采用 人 调理 标记的 或 ,以感染指数()分别刺激两种中性粒细胞、后,采用台盼蓝猝灭细胞外荧光,终止反应,流式细胞仪测定 波长下的荧光强度,即中性粒细胞吞噬的细菌数量。的免疫荧光染色和胞外 定量将两种中性粒细胞以 个 孔接种于涂布聚赖氨酸的玻片上,分为 组,前 组分组同,第 组为 刺激组,每组 复孔。后,多聚甲醛固定,透化,加入()抗体,孵育过夜,采用 标记的山羊抗兔 二抗()孵育,染色 ,正置荧光显微镜下观察 的形成,统计 个随机视野下形成 的中性粒细胞百分比。为对 形成后的胞外 水平进行定量,将两种中性粒细胞分为 组,每组 复孔。前 组同上,后,加入 特异性染料,避光孵育
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