DB32/T 4677—2024 周丛生物综合调查与分析测试技术规程.pdf
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1、!7,江苏省市场监督管理局发布中 国 标 准 出 版 社出版周丛生物综合调查与分析测试技术规程Technical code of practice for survey,analysis and determination of periphyton2024-02-05 发布2024-03-05 实施CCS Z 06DB32/T 46772024ICS 13.020.01DB32/T 46772024前言1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 采样点位布设24.1 布点原则24.2 布点前期准备24.3 布点要求35 样品采集与保存45.1 材料和器具45.2 样品采集45.3 样品
2、的处理与储存56 物理指标分析测试56.1 覆盖度测定56.2 厚度测定66.3 二维形态表征76.4 三维结构表征77 化学指标分析测试87.1 总有机碳、总无机碳和总碳含量87.2 总氮、氨氮、亚硝态氮和硝态氮含量97.3 磷含量97.4 钾含量107.5 钠含量107.6 钙、镁含量117.7 硫含量117.8 铁含量117.9 锰含量127.10 铜含量127.11 锌含量137.12 钼含量137.13 硅含量137.14 氯含量14目 次DB32/T 467720247.15 硼含量148 生物指标分析测试158.1 微生物组成和多样性158.2 磷脂脂肪酸群落结构158.3 胞外
3、聚合物178.4 生物量188.5 叶绿素含量18附录 A(资料性)周丛生物采样点位信息记录表19附录 B(资料性)周丛生物原位采样器20附录 C(资料性)周丛生物野外采样记录21DB32/T 46772024前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国土壤质量标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位:中国科学院南京土壤研究所、中国环境科学研究院、中国科学院水生生物研究所、河海大学、南京林业大学、中国科学院亚热带农业生态研究所、江苏省农业科学
4、院。本文件主要起草人:吴永红、孙朋飞、徐滢、周蕾、刘俊琢、陆海鹰、李丹、王思楚、陈志浩、王凯、周晴晴、陶静、李庭芳、刘凌佳、韩燕云、吴丽蓉、金泽凡、相棣、李志福、罗华溢、刘苏贤、孙宇婷、卢少勇、吴辰熙、李九玉、夏永秋、佘冬立、沈健林、张松贺、冯彦房。DB32/T 46772024周丛生物综合调查与分析测试技术规程1 范围本文件规定了周丛生物调查点位布设、样品采集与保存以及物理、化学和生物指标分析测试的要求。本文件适用于稻田、沟渠、河流、水库、湖泊等湿地或浅水水体中周丛生物采样点的布设、采集、保存以及物理、化学和生物性质的定量表征或测试分析。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用
5、而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 30988多酚类植物基因组 DNA 提取纯化及测试方法GB/T 30989高通量基因测序技术规程GB/T 33834微束分析扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法GB/T 35871粮油检验谷物及其制品中钙、钾、镁、钠、铁、磷、锌、铜、锰、硼、钡、钼、钴、铬、锂、锶、镍、硫、钒、硒、铷含量的测定电感耦合等离子体发射光谱法DZ/T 0279.27区域地球化学样品分析方法第 27 部分:有机碳量测定重铬酸钾容量法HJ 634 土壤氨氮、
6、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的测定氯化钾溶液提取分光光度法HJ 897水质叶绿素 a 的测定分光光度法HJ/T 345水质铁的测定邻菲啰啉分光光度法JY/T 0586 激光扫描共聚焦显微镜分析方法通则LY/T 1246森林土壤交换性钾和钠的测定LY/T 1250森林土壤碳酸钙的测定LY/T 1270森林植物与森林枯枝落叶层全硅、铁、铝、钙、镁、钾、钠、磷、硫、锰、铜、锌的测定NY/T 88土壤全磷测定法NY/T 149土壤有效硼测定方法NY/T 1378土壤氯离子含量的测定NY/T 2017植物中氮、磷、钾的测定NY/T 3030棉花中水溶性总糖含量的测定蒽酮比色法SN/T 3926出口乳、蛋、豆类食
7、品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 周丛生物 periphyton淹水环境下附着生长于固体基质表面的藻类、细菌、原生动物和后生动物等微生物及其代谢产物和1DB32/T 46772024有机碎屑交织在一起形成的聚合体。3.2 周丛生物覆盖度 periphyton coverage单位面积内附着生长在基质表面的周丛生物面积占总面积之比。注:一般用百分数表示。3.3 周丛生物粗糙度 periphyton roughness周丛生物表面孔隙和空隙占整个体积的比例。3.4 周丛生物多样性 biodiversity of periphyton周丛生物内显著不同
8、的种群之间以及同一种群内的遗传变异,涉及周丛生物中多种多样活的有机体(藻类、细菌、原生动物和后生动物)的种类、数量及其在周丛生物中的分布信息。3.5 周丛生物胞外聚合物 extracellular polymeric substances(EPS)of periphyton在一定环境条件下由周丛生物内细菌、微藻等微生物分泌于细胞外的主要由多糖、蛋白质和核酸等组成的大分子聚合物。3.6 周丛生物生物量 biomass of periphyton某一时间段内单位面积或单位体积内周丛生物实存生活的有机物质(干重)总量。注:通常用 g/cm2或 g/cm3表示。4 采样点位布设4.1 布点原则4.1.
9、1 科学性原则采样点位应具有典型性和代表性,能充分满足调查评估工作的目标要求,能真实反映水域生态系统中周丛生物真实分布情况。4.1.2 系统性原则布设点位宜涵盖调查区域范围内周丛生物可能分布的类型,采样点数量宜满足统计学要求。4.1.3 重点性原则宜把调查区域内水域生态系统及稻田作为调查重点区域。周丛生物生物量、性质、水动力和生境差异较大时,宜提高点位布设密度。4.1.4 持续性原则布设点位确定后宜长期保持固定。4.2 布点前期准备4.2.1 背景调查了解调查区域稻田、沟渠、池塘、河流和水库等水系分布信息及土壤、地形、灌溉、施肥、水文、气候等2DB32/T 46772024背景信息,采样点位信
10、息表详见附录 A。4.2.2 人员组织组织具有相关专业背景的人员,明确任务分工,对人员做好观测方法和野外操作规范的工作培训。加强野外调查安全培训工作,提高相关人员安全意识。4.3 布点要求4.3.1 农田生态系统布点4.3.1.1 稻田布点对于同一调查区域的稻田点位布设,应包含集约农业区、传统自耕区、重要水体上下游及附近的稻田,每类稻田至少布设 3 个采样点。若调查区域的稻田不存在差异化分布,布设点位的稻田应涵盖调查区域的流域范围,东南西北主要方位均有设点。尽量选择具有一定规模的连片稻田,避免将点位布设在6 667 m2(10 亩)以下孤立的小块稻田。稻田面积小于 66 667 m2(100
11、亩)的设 35 个点位,66 667 m2 666 667 m2(100 亩1 000 亩)的设 46 个点位,666 667 m2(1 000 亩)以上的设 610 个点位。稻田点位避免距离田垄较近的受人为扰动频繁的区域,尽量靠近稻田中心位置等相对稳定的地段。对于多个点位同时布设在同一稻田的情况,主要依据均匀随机布点的原则,根据周丛生物生长情况等进行实地调整,点位相互间距离应大于 5 m。4.3.1.2 沟渠布点沟渠点位应与稻田点位相对应,在每条沟渠中段布设 12 个点位,或布设不超过对应稻田样点数的点位。4.3.2 浅水生态系统布点4.3.2.1 河流布点在河流上、中、下游,干、支流,以及
12、干支流汇合点处均应设置点位。同一干/支流上任意两个相邻点位间的地理距离应大于 5 km,若河流较短,则采样点位应至少设置 3 个,覆盖河流的上、中、下游,宜包括不同生境(如浅滩、深潭、激流区、湍流区、缓流区、回水区、过渡区等)。4.3.2.2 池塘布点将点位布设在池塘的水陆交错带附近,水域面积小于 6 667 m2(10 亩)设 12 个点位,6 667 m220 000 m2(10 亩30 亩)设 23 个点位,大于 20 000 m2(30 亩)设 36 个点位。点位可围绕池塘均匀布设,但应覆盖进水区、出水区和池塘湾区。4.3.2.3 水库布点将点位布设在水库的水陆交错带附近,水域面积小于
13、 10 km2设 35 个点位,10 km250 km2设 46个点位,大于 50 km2设 58 个点位,超过 100 km2设 1020 个点位。点位可围绕水库均匀布设,但应覆盖进水区、出水区和水库中段。4.3.2.4 湖泊布点根据湖泊水体形态特点、水文状况和周丛生物的分布特征以及水体受干扰状况等因素,将湖泊区域划分成相对均质的敞水区、湖滨带,污染区或相对清洁区等,每个小区内设置 13 个有代表性的点位,主3DB32/T 46772024要分布在湖滨带。对于均质化程度较高的湖泊,可按照水库布点方法均匀设置点位。4.3.2.5 湿地布点对于非均一地面的湿地,每类设置 13 个点位。对于均一地
14、面的湿地,点位布设应在区域内进行简单随机抽样代替整体分布,面积小于 1 km2设 35 个点位,面积 1 km210 km2设 58 个点位,面积大于10 km2可按照水库布点方法均匀设置点位。5 样品采集与保存5.1 材料和器具5.1.1 主要材料蒸馏水或同等纯度的水、冰袋和液氮等。5.1.2 主要器具金属刮刀、镊子、短尺、样品袋或样品瓶、聚乙烯样品袋或螺纹盖玻璃瓶、一次性无菌手套、GPS 定位仪、温度计和便携 pH 计等。5.2 样品采集5.2.1 采样计划制定要点5.2.1.1 确定采样基质根据生境类型或沟渠、河流底质,确定周丛生物附着的基质。池塘、水库、湖泊以近水岸的无机基质(如石头等
15、)和有机基质(如水生植物等)作为周丛生物附着基质,稻田以表层土壤作为周丛生物附着基质。不同基质上的样品分开收集保存。5.2.1.2 确定样品数每份样品保证取至少 3 个平行样品。5.2.2 采样时间和采样频率5.2.2.1 农田生态系统采样时间和频率水稻移栽后每月采集样品一次,移栽后第一个月可半月采集一次。农田沟渠周丛生物采样时间和频率与稻田采样相对应。5.2.2.2 浅水生态系统采样时间和频率河流、池塘、湖泊、水库、湿地等生境的周丛生物宜按季节或丰、平、枯水期开展采样。采样时间间隔宜相同,选择一天中的同一时段。5.2.3 样品采集方法5.2.3.1 确定采样容积每个样点采集的周丛生物容积应保
16、持一致。混合采样应根据混合点数量确定每点采集量。4DB32/T 467720245.2.3.2 采样顺序需采集周丛生物上覆水或下层土壤样品时,应先采集水样后再采集周丛生物和土壤样品。5.2.3.3 样品刮取使用镊子或刮刀等工具从水下浸没的介质,包括稻田土壤、水生植物、石块表面剥离周丛生物,并移至聚乙烯采样袋内。5.2.3.4 原位厚度检测利用原位采样器对周丛生物进行原位厚度检测和固定,原位采样器可参考附录 B。5.2.3.5 器具清洗应及时清洗所有接触过样品的采样器具,使用前使用 0.1 mol/L 盐酸溶液消毒。5.2.4 样品标识和记录5.2.4.1 样品标识在样品袋或样品瓶外侧标注样品编
17、号、采样日期、水体名称、采样点位、采样人姓名。5.2.4.2 样品记录采样现场应记录样品经纬度、生境情况等信息,记录表格可参考附录 C。5.3 样品的处理与储存5.3.1 样品储存容器5.3.1.1 常规样品保存周丛生物一般常用聚乙烯袋存储。5.3.1.2 特殊样品保存有机物污染的周丛生物宜采用带有螺纹盖的玻璃瓶。5.3.2 样品运输和储存5.3.2.1 从田间采样到进行分析之前宜储存在 0 4 的保温箱中。5.3.2.2 运输中应仔细存放样品,以确保样品无破损、样品之间无污染。避免强光照射及强烈震动。5.3.2.3 周丛生物样品运至实验室后,分析物理指标的样品应风干或储存于 4,分析化学指标
18、的样品应进行液氮处理并储存于-20,分析生物指标的样品应进行液氮处理并储存于-80。6 物理指标分析测试6.1 覆盖度测定6.1.1 被测点选定在拟开展调查的生境内,随机选定观测点,点与点之间间距为 15 m30 m。观测点数参照第 4 章5DB32/T 46772024执行。6.1.2 针刺法测定覆盖度覆盖度应在采样现场测定。将 1 m2的被测点方框以间隔网格线方式划分为 10 cm10 cm,15 cm15 cm,20 cm20 cm 三种不同格网密度,并重复该过程 5 次10 次,取均值作为该被测点的最终结果。6.1.3 覆盖度计算测量每个随机被测点的覆盖面积,求取平均值,然后乘以总的稻
19、田面积得到所测稻田的周丛生物面积。覆盖度为周丛生物面积占稻田总面积之比,一般用百分数表示。覆盖度(PBC)计算见公式(1):PBC=SAveragecoverage STotalareaSTotalarea 100(1)式中:SAveragecoverage被测点(1 m2)内覆盖面积的平均值,单位为平方米(m2);STotalarea所研究稻田区域的总面积,单位为平方米(m2)。6.2 厚度测定6.2.1 材料与设备6.2.1.1 主要试剂:蒸馏水或同等纯度的水、二甲基亚砜溶液、绿色荧光核酸染料、0.9%氯化钠溶液(生理盐水)和抗荧光淬灭封片剂等。6.2.1.2 主要材料:载玻片、盖玻片、培
20、养皿、吸水纸、离心管和锡箔纸等。6.2.1.3 主要设备:激光扫描共聚焦显微镜等。6.2.2 测定步骤6.2.2.1 样品制备6.2.2.1.1 用镊子取小块新鲜的周丛生物于洁净载玻片,并放置于洁净的培养皿中,用 0.9%氯化钠溶液(生理盐水)轻柔洗去表面残余培养液和杂质。6.2.2.1.2 染料的配制:取洁净离心管,用锡箔纸包紧,向其中加 1 mL 二甲基亚砜溶液,取 1.5 L 绿色荧光核酸染料加入二甲基亚砜溶液中,振荡混匀,待用。6.2.2.1.3 加 200 L 染料于载玻片上,确保整个片子被染料液覆盖,用锡箔纸包起放有载玻片的培养皿,染色 20 min30 min 后,取出载玻片,并
21、将其边缘液体吸干,加 10 L 抗荧光淬灭封片剂到洁净的盖玻片上,将盖玻片放置于周丛生物上压紧,并排除气泡,确保视野清晰不流动。将制备好的片子用锡箔纸包好,用激光扫描共聚焦显微镜观察。6.2.2.2 激光扫描共聚焦显微镜成像激光共聚焦扫描显微镜对染色周丛生物进行显微观察和图像采集,用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描限制在周丛生物样品的一个平面内。调焦深度不一样时,可以获得周丛生物不同深度层次的图像。激光扫描共聚焦显微镜分析方法应按照 JY/T 0586 要求分析。6.2.2.3 最大厚度测定对周丛生物样本由内(周丛生物与玻片相贴面)向外(周丛生物游离面)沿三维坐标系 Z 轴逐
22、层水平扫描,步距 14 m,当出现 2 个连续的水平层面,Z 轴距离较小的水平层面上能够观察到周丛生物结构,Z轴距离较大的水平层面上不能够观察到周丛生物结构,则后一水平层面的 Z 轴距离为周丛生物最大厚6DB32/T 46772024度(单位为 m)。6.3 二维形态表征6.3.1 材料与设备6.3.1.1 主要试剂:蒸馏水或同等纯度的水、2.5%戊二醛溶液、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)和1%锇酸固定液等。6.3.1.2 主要材料:盖玻片、滤膜、吸水纸和离心管等。6.3.1.3 主要设备:冷冻干燥机和扫描电子显微镜等。6.3.2 测定步骤6.3.2.1 样品制备6.3.2.
23、1.1 取适量周丛生物展片于盖玻片或滤膜上,用 2.5%戊二醛溶液固定 2 h,0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)漂洗三次,每次 10 min,再用 1%锇酸固定液固定 1 h2 h,固定结束再重复磷酸盐缓冲液漂洗过程。6.3.2.1.2 将固定好的周丛生物样品冷冻干燥处理,以接近于物质的自然状态直接放到扫描电镜中进行观察。6.3.2.1.3 若观察割裂面结构,应根据需求从不同角度切割周丛生物样品。6.3.2.1.4 若试样导电性弱时,一般选择镀膜处理。通常情况选择镀金(Au)膜,如果对分辨率有较高的要求,可以选择镀铂(Pt)、铬(Cr)、铱(Ir)。如果要对样品进行严格的化学定
24、量分析,则不能镀金属膜,因为金属膜对 X 射线有较强的吸收,对定量有较大影响,可选用蒸镀碳膜。6.3.2.2 扫描电子显微镜成像应按照 GB/T 33834 要求进行扫描电子显微镜成像。6.4 三维结构表征6.4.1 材料与设备6.4.1.1 主要试剂:蒸馏水或同等纯度的水、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)等。6.4.1.2 主要材料:载玻片、滤膜和吸水纸等。6.4.1.3 主要设备:激光扫描共聚焦显微镜。6.4.2 测定步骤6.4.2.1 样品制备取小片新鲜周丛生物或直接剪切至所需大小置于洁净载玻片上,用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4)漂洗三次,每次 10
25、min,以除去杂质。6.4.2.2 三维结构成像激光扫描共聚焦显微镜观察周丛生物样品并采集不同层面图像,构建三维图像。激光扫描共聚焦显微镜分析方法参照 JY/T 0586。7DB32/T 467720246.4.3 注意事项6.4.3.1 扫描过程耗时较长,而且只能扫描不动的微生物,许多活动的大型微生物,例如周丛生物中原生动物等,因运动比较剧烈而会对成像造成一定的影响。6.4.3.2 某些环境杂质可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响。在样品制备中尽可能清洗干净,同时适当地调整激光的光强,用最弱的光对样品进行照射扫描。7 化学指标分析测试7.1 总有机碳、总无机碳和总碳含量7.1.1 测
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