吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制.pdf
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1、中药有效成分研究吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制刘磊彭琴吴泽明黄欣慧张广献谭宇蕙(广州中医药大学基础医学院广州 )摘 要 目的 探讨吴茱萸碱对肿瘤血管增生的抑制作用及其机制 方法以不同浓度的吴茱萸碱、二氯化钴()单独或联合处理人脐静脉内皮细胞()或人肝癌细胞()采用噻唑蓝()法检测细胞增殖水平变化/双染流式细胞术检测吴茱萸碱对 凋亡的影响采用 化学诱导法建立 体外模拟缺氧模型免疫印迹法()检测 的缺氧诱导因子()、代谢酶()和血管内皮生长因子受体()蛋白表达水平 结果 检测结果显示吴茱萸碱对、细胞增殖均有显著的抑制作用(.或.)半数抑制浓度分别为.、.流式细胞术结果表明吴茱萸碱可以诱导
2、 凋亡(.)在常氧条件下吴茱萸碱对 的、蛋白抑制不明显但能显著下调 蛋白表达水平(.)可使 的 和 蛋白表达水平显著升高(.)且呈浓度依赖性而细胞增殖水平未见明显变化但 时细胞生存率明显升高 时细胞生存率明显降低(.)诱导 高表达条件下吴茱萸碱(.)能显著下调、和 的蛋白表达水平和细胞生存率(.)与吴茱萸碱组比较联合(吴茱萸碱)组、蛋白水平及细胞生存率均上调(.)而 不上调 结论 吴茱萸碱对 和 细胞增殖均有显著的抑制作用且诱导 凋亡在 模拟缺氧条件下吴茱萸碱可显著下调 的糖酵解(效应)其机制可能与独立下调 和 两条信号通路有关关键词 吴茱萸碱血管增生糖酵解缺氧诱导因子血管内皮生长因子受体中图
3、分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()().()()().()/()()().(.).(.).(.).(.).(.).(.)(.).(.).().医药导报 年 月第 卷第 期 统计报告显示 年全球新发癌症约 万例癌症患者死亡 万例其中我国新增癌症病例约 万死亡病例 万 大多数癌症患者确诊时已进入进展期或者中晚期肿瘤已开始通过血行播散转移 肿瘤血管生成是肿瘤生长、进展和转移的重要因素抑制血管生成已成为临床批准的治疗方法然而目前却受到可选药少、疗效不足或耐药性的限制 由于肿瘤细胞迅猛增殖代谢水平高实体肿瘤中心区域容易出现缺血缺氧的状态而缺氧能促进血管增生诱导血管生成是
4、肿瘤的十大特征之一其病理性血管增生是以新生毛细血管的形成为主而内皮细胞是构成毛细血管管壁的主要细胞其来源于内皮祖细胞增殖分化或自身的继续增殖分裂而内皮(祖)细胞增殖分化及迁移被证实是恶性肿瘤血管增生的重要环节 有报道指出内皮(祖)细胞增殖也像癌细胞一样依赖瓦伯格效应(即依靠大量糖酵解提供合成代谢和能量代谢的原料)因此通过调整内皮(祖)细胞代谢以抑制血管增生可能是抗癌的新策略吴茱萸碱()是吴茱萸的主要活性成分之一 现代研究发现 具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、保护心血管系统及神经等药理作用 本课题组前期已证实 对肝癌细胞的瓦伯格效应有显著的抑制作用那么 能否抑制血管内皮细胞的瓦伯格效应?是否通过影响内皮
5、细胞糖代谢而抑制其增殖生长从而抗血管增生?这些尚不明确 本研究通过体外模拟人脐静脉内皮细胞()体内的缺氧状态观察常氧和缺氧下内皮细胞糖代谢相关酶的变化、的干预作用及相关信号通路变化探讨 抗血管增生的作用及机制 材料与方法.材料.细胞 购自广州浩玛生物科技有限公司(货 号:)人 肝 母 细 胞 肝 癌 细 胞 株()由广州中医药大学基础医学院生物化学实收稿日期 修回日期 基金项目国家自然科学基金资助项目()作者简介 刘磊()男江西宜春人在读硕士研究方向:中西医结合肿瘤防治与药理:.通信作者 谭宇蕙()女广东恩平人教授博士生导师研究方向:中西医结合肿瘤防治与药理电话:.验室长期保存.药物及试剂 购
6、自成都曼思特有限公司(批号:)六水合氯化钴()购自上海麦克林生化科技有限公司(批号:)内皮细胞专用培养基购自广州浩玛生物科技有限公司(货号:)胎牛血清购自武汉普诺赛生命科技有限公司(批号:)高糖达尔伯克必需基本培养基()购 自 美 国 公 司(货 号:)噻唑蓝()试剂盒、二甲亚砜、/细胞凋亡检测试剂盒均购自广州瑞舒生物科技有限公司(货号分别为:、)聚 偏 二 氟 乙 烯()膜购自(货号:)山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均购自(批号:、)鼠抗 抗体、兔抗 抗体、兔抗 抗体均购自 公司(批号分别为、)兔抗 抗体购自 公司(批号:).仪器与设备 二氧化碳()细胞培养箱(美国 公司型号:)超净工作台(上海
7、博迅医疗生物仪器股份有限公司型号:)多功能酶标仪(公司型号:)流式细胞分析仪(美国 公司型号:)蛋白垂直电泳系统、蛋白转印系统(美国 公司)全自动化学发光图像分析系统(上海天能仪器有限公司型号:).方法.细胞培养将、细胞分别置于内皮细胞专用培养基、胎牛血清高糖 培养基中、饱和湿度条件下常规培养细胞密度达到 用含.乙二胺四乙酸()的胰酶消化、离心并收集细胞(离心率 离心 )加入内皮细胞专用培养基或 培养液制成单细胞悬液选取第 代细胞进行后续实验.法检测细胞增殖情况取对数生长期、细胞分别制成单细胞悬液均以每孔 个、细胞悬液 接种于 孔板培养 即细胞贴壁设置空白组(无细胞对照)、对照组(细胞对照)、
8、实验组 和(或)实验组每孔加入不同浓度的(.、.、.、.、.)或(、)或二者联合 每个浓度梯度设置 个平行复孔 药物干预 避 光每孔加入 溶液 继续孵育 吸弃上清液后每孔加入二甲亚砜 避光震荡 酶标仪检测波长处 吸光度值(值)细胞存活率()(实验组空白组)/(对照组空白组)改良寇式法计算半数抑制浓度():()()/及 ().流式细胞术检测 细胞凋亡水平以每孔 个 接种至 孔板待细胞贴壁后设置对照组和 各浓度组 处理 用不含 的胰酶消化、离心细胞磷酸盐缓冲液重悬并离心细胞 次收集细胞制成单细胞悬液使用/双染料联合标记避光孵育 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.体外模拟缺氧模型建立 参照“.节”以(、
9、)干 预 法检测 对细胞增殖的影响和参照“.”项(、和、)干预 检测 的 蛋白表达水平以选择合适浓度的建立体外模拟缺氧模型.检测以每孔 个 接种至 孔板待细胞贴壁后经 或(和)干预 使用 裂解液提取细胞内总蛋白 法测定总蛋白浓度加入 倍十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝 胶()上样缓冲液稀释为 倍工作液置于金属浴中加热 使蛋白变性 然后使用 凝胶电泳分离目的蛋白采用湿转法将目的蛋白转印至 膜上脱脂奶粉室温封闭 分别放入鼠抗 抗体、兔抗、抗体中(稀释)孵育过夜 经 缓冲液洗涤 重复 次后加入辣根过氧化酶()标记二抗室温孵育 缓冲液再洗涤 次后采用电化学发光法显影拍照并保存图像 使用 软件测量条带灰度值
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