天津地区1例凡纳滨对虾病害的病原学检测与分析.pdf
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1、Advances in Microbiology 微生物前沿微生物前沿,2023,12(2),55-62 Published Online June 2023 in Hans.https:/www.hanspub.org/journal/amb https:/doi.org/10.12677/amb.2023.122007 文章引用文章引用:孙妍,刘群,徐赟霞,陈浩楠,赵良玮,董学旺,魏俊利.天津地区 1 例凡纳滨对虾病害的病原学检测与分析J.微生物前沿,2023,12(2):55-62.DOI:10.12677/amb.2023.122007 天津地区天津地区1例凡纳滨对虾病害的病原学例凡纳
2、滨对虾病害的病原学 检测与分析检测与分析 孙孙 妍妍1,2,刘刘 群群1,2,徐徐赟赟霞霞1,2,陈浩楠陈浩楠1,2,赵良玮赵良玮1,2,董学旺董学旺1,2,魏俊利魏俊利1,2 1天津市动物疫病预防控制中心,天津 2天津市水生动物疫病监测中心,天津 收稿日期:2023年3月10日;录用日期:2023年5月31日;发布日期:2023年6月9日 摘摘 要要 采用流行病学调查、细菌分离鉴定、寄生虫观察和分子生物学方法对天津滨海新区凡纳滨对虾养殖场采采用流行病学调查、细菌分离鉴定、寄生虫观察和分子生物学方法对天津滨海新区凡纳滨对虾养殖场采集的集的1例患病凡纳滨对虾例患病凡纳滨对虾(Litopenaeu
3、s vannamei)样品开样品开展病原学研究。寄生虫和细菌鉴定结果显示,展病原学研究。寄生虫和细菌鉴定结果显示,患病对虾未发现寄生虫和细菌感染;病原学检测结果显示,患病对虾虾肝肠胞虫患病对虾未发现寄生虫和细菌感染;病原学检测结果显示,患病对虾虾肝肠胞虫(EHP)和传染性肌坏死和传染性肌坏死病毒病毒(IMNV)核酸检测结果均为阳性,其它相关病原检测结果均为阴性;核酸检测结果均为阳性,其它相关病原检测结果均为阴性;EHP、IMNV目的基因产物测序目的基因产物测序后经后经NCBI BLAST,与已报道的,与已报道的EHP、IMNV相关序列相似性分别介于相关序列相似性分别介于99.56%100%、9
4、8.33%100%;系统发育树分析结果显示,本研究系统发育树分析结果显示,本研究EHP孢壁蛋白孢壁蛋白1基因与马来西亚分离株、印度尼西亚分离株、泰国分离基因与马来西亚分离株、印度尼西亚分离株、泰国分离株及印度分离株的株及印度分离株的EHP孢壁蛋白孢壁蛋白1基因聚为一支,亲缘关系较近;基因聚为一支,亲缘关系较近;IMNV TJ2022 OQ438431与印度尼西与印度尼西亚分离株、印度分离株、巴西分离株聚为一支,亲缘关系较近。揭示本研究凡纳滨对虾发病样品可能由亚分离株、印度分离株、巴西分离株聚为一支,亲缘关系较近。揭示本研究凡纳滨对虾发病样品可能由EHP和和IMNV感染所致,需引起养殖从业者的高
5、度关注。感染所致,需引起养殖从业者的高度关注。关键词关键词 凡纳滨对虾凡纳滨对虾,传染性肌肉坏死病毒传染性肌肉坏死病毒,虾肝肠胞虫虾肝肠胞虫,系统进化树分析系统进化树分析 Pathogenic Detection and Analysis of a Case of Litopenaeus vannamei Disease in Tianjin Yan Sun1,2,Qun Liu1,2,Yunxia Xu1,2,Haonan Chen1,2,Liangwei Zhao1,2,Xuewang Dong1,2,Junli Wei1,2 1Animal Disease Prevention and
6、Control Center of Tianjin,Tianjin 2Tianjin Surveillance Center of Aquatic Animal Infections Disease,Tianjin Received:Mar.10th,2023;accepted:May 31st,2023;published:Jun.9th,2023 孙妍 等 DOI:10.12677/amb.2023.122007 56 微生物前沿 Abstract In this article,the laboratory diagnostic analysis,including epidemiolo
7、gical investigation,isola-tion and identification of bacteria,microscopic observation of parasites and PCR detection of var-ious pathogenic bacteria in shrimp were carried out to identify the pathogen of diseased Litope-naeus vannamei in Tianjin Binhai district.The identification results of parasite
8、s and bacteria showed that there were no parasites and bacterial infections in this batch of diseased shrimp;The results of pathogenic PCR showed that EHP and IMNV were positive;The sequences of the PCR products showed 99.56%to 100%,and 98.33%to 100%similarity with the reported EHP and IMNV separate
9、ly,after sequencing and BLAST on NCBI.The phylogenetic analysis of the target se-quence showed that the amplified EHP gene sequence had the highest similarity with the EHP cell wall protein 1 sequence of Malaysia isolate,Indonesia isolate,Thailand isolate and India isolate;the amplified IMNV gene se
10、quence had high affinity with the Indonesian isolate,Indian isolate and Brazilian isolate of each year,which was clustered into one branch.It was revealed that the dis-eased Litopenaeus vannamei may be caused by the co-infection of EHP and IMNV,which should pay more attention.Keywords Litopenaeus va
11、nnamei,Infectious Myonecrosis Virus,Enterocytozoon hepatopenaei,Phylogenetic Tree Analysis Copyright 2023 by author(s)and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License(CC BY 4.0).http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/1.引言引言 凡纳滨对虾(Litopenae
12、us vannamei)于 1988 年被引进中国以来,几乎取代了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)获得巨大的经济效益。然而随着养殖规模和养殖密度的不断扩大,加之生态环境的不断恶化,凡纳滨对虾的病害问题日益突出。2017 年山东省虾蟹养殖产业现状调查研究显示,对虾病害发生情况趋势逐年加重,对虾白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、弧菌等常见疫病并未从根本上解决,对虾肝肠胞虫病、虾虹彩病毒病等新发疫病也在该省对虾养殖区出现,并造成极大经济损失1;2019年天津地区土池淡水对虾养殖现状分析报告也显示,抽样调查的 10 个亏损池塘中,80%是由对虾偷死野田村病和急性
13、肝胰腺坏死症导致2;2019 年江苏地区凡纳滨对虾养殖病害主要包括虾肝肠胞虫、急性肝胰腺坏死症等3;2021 年河北省对虾病害分析报告指出虾肝肠胞虫阳性检出率最高,提示未来可能造成较大经济损失4。由此可见,病害问题已成为制约我国凡纳滨对虾产业增产增效的主要原因。苗种和亲本的大规模跨国际、跨区域移动现象在我国凡纳滨对虾养殖中十分普遍,导致对虾疫病被伴随传入我国并扩散5,给养殖户造成巨大经济损失,已呈现出由南方向北方扩展的流行趋势。因此,需高度重视对虾新发疫病的暴发,加大新发疫病的监测力度,已成为我国对虾养殖可持续发展的迫切要求。2022 年 12 月,天津市滨海新区几个相邻的凡纳滨对虾工厂化养殖
14、车间相继发生对虾缓慢死亡,体长不均一,部分对虾尾部肌肉白浊等现象。本研究以其中 2 个工厂化车间症状典型的凡纳滨对虾为研究Open AccessOpen Access孙妍 等 DOI:10.12677/amb.2023.122007 57 微生物前沿 对象,开展病原学鉴定,旨在初步探索潜在的发病致病原,为我国北方地区凡纳滨对虾的病害防控提供借鉴。2.材料与方法材料与方法 2.1.材料材料 2.1.1.试验动物试验动物 试验用患病凡纳滨对虾采自天津市滨海新区某养殖场的 2 个工厂化车间,平均体长为(4.0 1.3)cm,病虾活体充氧打包后立即运送本实验室,在无菌条件下按照样品检测要求处理。2.1
15、.2.试剂及仪器试剂及仪器 主要试剂:CTAB 购自北京索莱宝;Premix Ex Taq、无酶水等购自 TaKara;营养琼脂、营养肉汤等购自北京陆桥;引物由英俊公司合成纯化;测序工作由上海生工完成。主要仪器:高速冷冻离心机(艾本德);PCR 仪(ABI);微量移液器(艾本德);电泳仪(北京六一);凝胶成像系统(伯乐)。2.2.方法方法 2.2.1.患病对虾流行病学调查及临床症状观察患病对虾流行病学调查及临床症状观察 2022 年 12 月,天津市滨海新区几个相邻的工厂化养殖场养殖的凡纳滨对虾出现了摄食量降低、活力差、尾部肌肉白浊、体长规格不均一、缓慢死亡等症状。经调查,该养殖场及周边养殖场
16、此前未发生此类病症,所购苗种源于外省市某苗种场。养殖时间约 30 天,养殖水温约 26,放养密度约 1 万尾/m2,发病持续时间约 14 天,累计死亡率约 30%,且抗生素、益生菌等药物和免疫增强剂的使用效果欠佳。现场采集具有典型症状的对虾置于车载低温冰箱,并带回实验室进行采样分析。2.2.2.细菌及寄生虫检查细菌及寄生虫检查 挑取具有典型症状的患病对虾,无菌条件下分别将患病对虾鳃丝、肌肉、肝胰腺、心脏以及淋巴器官等接种于营养琼脂平板,28培养 48 h,观察细菌生长情况,挑取优势菌纯化 3 次,置于装有 20%甘油的营养肉汤培养基中,80保存备用。采用 SN/T 2503-2010淡水鱼中寄
17、生虫检疫技术规范6中水浸片显微镜检测方法进行病虾肝胰腺、鳃丝、心脏、肌肉、附肢等部位寄生虫的检测。2.2.3.菌株菌株 16S rDNA 的鉴定的鉴定 采用水煮法提取保存菌株的 DNA 7,并使用 16S rDNA 通用引物对分离出的菌株 DNA 进行 PCR扩增,上游引物序列为 27F:5AGAGTTTGATCCTGG 3,下游引物序列为 1492R:5GGTTACCTTGTTACGACTT 3。扩增的 PCR 产物送上海生工测序,测序结果通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)网站进行在线比对。2.
18、2.4.病毒检测病毒检测 将患病对虾的鳃丝、肝胰腺、肌肉等组织进行解剖混合后,打碎研磨成组织匀浆液,采用 2%CTAB法8提取组织匀浆液的核酸。根据 GB/T 28630.2-2012 9、GB/T 25878-2010 10、SC/T 7232-2020 11、SC/T 7237-2020 12、SC/T 7233-2020 13、SN/T 3492-2013 14、SN/T 1151.1-2011 15中相关病原 PCR检测方法分别进行对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、对虾传染性皮下及造血器官坏死病病毒(Infectious hypoder
19、mal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、对虾虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)、对虾急性肝胰腺坏死症(Acute 孙妍 等 DOI:10.12677/amb.2023.122007 58 微生物前沿 Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)、对虾传染性肌肉坏死病病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)以及桃拉病毒(Taura syndrome v
20、irus,TSV)的检测。若 PCR 结果为阳性,则将扩增产物送往上海生工测序,测序结果通过 NCBI 网站进行在线比对。2.2.5.相关阳性病原相关阳性病原基因序列的系统进化分析基因序列的系统进化分析 将测序反馈测序结果通过 NCBI 数据库中的 BLAST 程序(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列同源性分析,并从中分别下载相关基因序列,通过 Clustal x 软件进行多重比对,采用 MEGA 7 软件中邻接法(neighbor joining,NJ)构建系统发育树(Bootstrap 设置为 1000 次重复),以确定。3.结果与分析结
21、果与分析 3.1.患病虾的临床症状患病虾的临床症状 采集的患病虾体长规格不均一,活力差,部分对虾体色发白,附肢、游泳足、尾扇变红,尾部、腹部肌肉组织坏死,呈白浊状(见图 1)。Figure 1.Clinical symptoms of diseased Litopenaeus vannamei cultured in the temporary pond(The arrow indicates the white and turbid part of the muscle)图图1.养殖场采集患病凡纳滨对虾临床症状(箭头:肌肉白浊部位)3.2.细菌及寄生虫检测细菌及寄生虫检测 病虾鳃丝、肝胰腺、
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