裙带菜配子体与孢子体的附生微生物群落组成分析.pdf
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1、第 44 卷 第 5 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.44,No.5 2 0 2 3 年1 0 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct.,2023 *国家自然科学基金面上项目(42176100)、中国科学院战略生物资源能力建设项目(KFJ-BRP-017-27)和国家现代农业产业技术体系(CARS-50)共同资助。李昱倩,E-mail: 通信作者:单体锋,研究员,E-mail:;逢少军,研究员,E-mail: 收稿日期:2022-05-06,收修改稿日期:2022-05-31 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.20220506001 h
2、ttp:/ LI Y Q,SHAN T F,PANG S J.Composition of epiphytic microbial communities in gametophytes and sporophytes of Undaria pinnatifida.Progress in Fishery Sciences,2023,44(5):219230 裙带菜配子体与孢子体的附生 微生物群落组成分析*李昱倩1,2 单体锋1 逄少军1(1.中国科学院海洋研究所 中国科学院实验海洋生物学重点实验室 山东 青岛 266071;2.中国科学院大学 北京 100049)摘要 裙带菜(Undaria
3、pinnatifida)是一种重要的大型褐藻,具有较高的经济和食用价值。藻类的附生微生物既能通过代谢产物调控宿主藻类的生长发育,特定条件下又可能导致病害。了解裙带菜附生微生物群落组成对研究裙带菜与附生微生物间的相互作用、种质资源的有效保存以及防治藻类病害等有重要意义。现有研究大多集中于海带和紫菜,关于裙带菜的附生微生物,特别是不同生活史的对比研究还很少。本研究通过 16S rRNA 基因高通量测序发现,裙带菜配子体和孢子体的附生细菌群落组成有明显差异,配子体样品中的细菌群落丰度和多样性均大于孢子体。配子体中变形菌门(Proteobacteria)(66.67%)为第一优势菌门,其次为拟杆菌门(
4、Bacteroidetes)(13.48%)和蓝细菌门(Cyanobacteria)(11.13%),-变形菌纲(Alphaproteobacteria)(34.58%)为第一优势菌纲,其次为-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(31.01%);而孢子体中蓝细菌门(95.67%)占绝对优势,其次为放线菌门(Actinobacteria)(1.65%)和厚壁菌门(Firmicutes)(1.48%)。裙带菜样品经 18S rRNA 基因测序检测出链形植物(Streptophyta)、纤毛虫门(Intramacronucleata)、担子菌门(Basidiomycota)、顶复亚门
5、(Apicomplexa)、节肢动物门(Arthropoda)、硅藻门(Bacillariophyta)、脊索动物门(Chordata)、腹毛动物门(Gastrotricha)、子囊菌门(Ascomycota)和毛霉菌门(Mucoromycota),其中,担子菌门、子囊菌门和毛霉菌门属于真菌,孢子体的真核微生物群落丰度大于配子体。本研究确定了裙带菜配子体和孢子体附生微生物群落组成以及不同细菌和真核微生物的相对丰度,结果表明,2 个世代之间存在显著差异,为后续研究藻类宿主与微生物之间的相互作用、提高海带目褐藻种质保存技术提供了基础的数据支持。关键词 裙带菜;附生微生物;高通量测序;孢子体;配子体
6、 中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0219-12 裙带菜(Undaria pinnatifida)是一种重要的经济海藻,生活史由微型的配子体和大型的孢子体交替组成,其栽培主要集中在中国、韩国和日本。据 2020 年中国渔业统计年鉴报道,我国裙带菜年产量超过 20 万 t,在经济褐藻中仅次于海带(农业农村部渔业渔政管理局等,2020)。与海带和紫菜等其他经济海藻相似,由于养殖面积和密度的增加以及渔业环境的恶化,裙带菜病害时有发生,造成养殖产量下降和经济损失。引220 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 发藻类病害的原因有附生微生物、附生藻
7、类、敌害生物、环境因素和管理不当等(杨慧超等,2019),其中由细菌等微生物引发的病害最为常见。Bell 等(1972)提出“藻际微环境”的概念,即藻类在生长的过程中向周围环境释放出有机物质,在藻体周围形成一种特殊的藻际环境,吸引微生物附着在藻体表面。藻类和附生微生物之间关系密切,藻类为附生细菌提供生长所需的有机物,附生细菌通过代谢产物为藻类提供营养物质和生长因子(Singh et al,2014),调控海藻的发育和生长,某些细菌还可以帮助海藻抵抗海洋环境中致病细菌的侵袭(姜健等,2005)。当藻际微环境维持动态平衡时,二者相互利用,共同生长发育;当二者关系失衡,例如,藻体受到损伤或环境因子发
8、生改变时,菌群结构就可能发生变化,造成藻类的病害(Egan et al,2014;梁珊珊,2019)。研究表明,附生微生物与海带、紫菜等经济海藻的烂苗脱苗病(陈等,1981)、赤腐病(马家海,1996a)、壶状菌病(马家海,1992)和绿斑病(李杰等,2019)等息息相关。已发现的引发藻类病害的大部分病 原 菌 属 于 革 兰 氏 阴 性 菌,例 如 交 替 单 胞 菌(Alteromonas)、黄杆菌(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、腐败螺旋菌(Saprospira)和弧菌(Vibrio)等(Ashen
9、et al,2000)。姜静颖等(1997)报道了由火神弧菌(Vibrio logei)引发的裙带菜绿烂病,该病原菌属于-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的弧菌属。马悦欣等(1997)研究表明,优美德利菌(Deleva venusta)是裙带菜斑点烂病的病原菌。因此,了解藻类附生微生物的群落组成对防治藻类病害有重要意义。此外,裙带菜种质资源常以配子体的形式保存,了解其附生微生物群落组成有助于开发有效的保存方法以及在培养无菌材料时去除微生物污染。附生微生物的群落组成与多种因素有关,裙带菜配子体世代(n)和孢子体世代(2n)在形态生理上的不同决定了其附生微生物的群落可能存在差异。
10、随着高通量测序技术的发展,以微生物基因组 DNA 的标记序列作为分类依据来分析微生物种群结构和多样性成为目前的常用方法。核糖体 RNA 操纵子在细胞中相对稳定,同时含有保守序列和高可变序列,是研究微生物系统分类的重要依据(车玉伶等,2005)。16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基 RNA 的DNA 序列,常用于研究细菌多样性;18S rRNA 基因是编码真核生物核糖体小亚基 RNA 的 DNA 序列,常用于真核生物类群的研究。本研究利用 Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台,通过 16S rRNA 和 18S rRNA 基因高通量测序对裙带菜孢子体和配子体的附生微
11、生物类群进行鉴别,分析比较不同世代裙带菜附生细菌及其他生物群落的组成和结构,为研究裙带菜与附生微生物间的相互作用、种质资源的有效保存以及防治藻类病害提供参考。1 材料与方法 1.1 实验材料 实验所用的裙带菜配子体和孢子体均来源于大连栽培群体,各 3 个生物学重复。其中,雌性、雄性和雌雄同体配子体各 1 个,编号分别为 HB1-21-2F、HB2-15-1M 和 7-3-3FM(标记为 G1、G2 和 G3)。它们为单个孢子衍生的克隆培养系,分别来自于“海宝1 号”、“海宝 2 号”品种及“7 号”品系,其建立时间均为 2017 年 6 月。保存条件为温度 16、光照 5 mol photon
12、s/(m2s),所用培养基为用煮沸的自然海水配制的 PES(Provasoli enriched seawater)(Provasoli,1968)。取样时,配子体为黄褐色,处于营养生长状态,培育密度约为 1 g/100 mL(鲜重)。孢子体为“海宝 1 号”的 3 个个体(标记为 S1、S2 和 S3)。孢子体为在水缸中培养的“海宝 1 号”的子代,培养基为添加 70 mg/L NaNO3和 10 mg/L NaH2PO4的自然海水,取样时海水的温度为1618,光强的日变化在 0120 mol photons/(m2s)。孢子体大小为 1520 cm,色泽黄褐色,取叶片中部用于后续的 DNA
13、 提取。1.2 建库测序 用磁珠法土壤和粪便基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司,DP712)提取样品总 DNA,进行 16S/18S rRNA 基因的测序和微生物多样性基本分析。其中,16S rRNA 基因的测序区间为 V3V4 区,18S rRNA 基因的测序区间为 V4 区。细菌 16S rRNA基因使用分析海藻附生菌群常用的引物 338F:5-AC TCCTACGGGAGGCAGCA-3和 806R:5-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3(Hong et al,2015;孙丕海等,2017;唐隆晨等,2020),18S rRNA 基因 v4 的引物为TAReuk
14、454FWD1:5-CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGT AATTCC-3和 TAReukREV3:5-ACTTTCGTTCTTGA T(C/T)(A/G)A-3(Stoeck et al,2010)。在引物末端加上测序接头,进行 PCR 扩增,对扩增产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库。质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500 进行双末端测序。第 5 期 李昱倩等:裙带菜配子体与孢子体的附生微生物群落组成分析 221 1.3 数据分析 使用 Trimmomatic v0.33 软件(Bolger et al,2014)对测序得到的原始序列(raw reads)进行过滤
15、;使用cutadapt 1.9.1(Martin,2011)去除引物序列,使用 FLASH v1.2.7(Mago et al,2011),通过重叠区域对序列进行拼接,得到 clean reads;使用 UCHIME v4.2(Edgar et al,2011)去除嵌合体序列,得到有效序列。使用 Usearch v10.0软件(Edgar,2013)对获得的有效序列在 97.0%的相似度水平下进行聚类,获得可操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),每个OTU对应一种代表序列。以SILVA132为参考数据库,使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学分析。使用
16、 QIIME2 2020.6(Bolyen et al,2019)对样品进行Alpha 和 Beta 多样性分析。2 结果与分析 2.1 16S rRNA 基因序列分析结果 2.1.1 有效序列及 OTU 所取的 6 个裙带菜样品经测序后共获得 460 754 对原始序列,序列已上传至美国国家生物技术信息中心数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/),序列号为 PRJNA823903。经双端质控、拼接后共产生 455 735 条 clean reads,过滤嵌合体后得到有效序列共 446 932 条,在 97.0%的相似度水平下聚类获得 OTU,配子体样品的平均 OTU
17、 数目(259)多于孢子体(110)(表 1)。表 1 16S rRNA 基因测序结果分析 Tab.1 Analysis of sequencing results of 16S rRNA gene 样品编号 Sample ID 有效序列数 Effective reads 可操作分类单元数OTUs G1 76 932 235 G2 76 979 276 G3 75 147 267 S1 79 062 109 S2 59 858 123 S3 78 954 98 从测序样本中随机抽取一定数量的序列,统计抽取序列包含的 OTU 数量构建稀释性曲线(图 1)。随着有效序列数目的增加,各组样品的稀释曲
18、线逐渐趋于平缓,表明获得的序列充分,可以较好地反映样品中细菌的多样性。2.1.2 Alpha 多样性分析 通过测序样品的 ACE指数、Chao1 指数、Shannon 指数、Simpson 指数和覆盖率来描述 Alpha 多样性(表 2)。各组测序结果的覆盖率均达到 99%以上,说明测序结果能较好地反映样品中细菌群落的真实情况;ACE 和 Chao1 指数能反映物种丰富度,裙带菜配子体样品的 ACE 和 Chao1 指数均显著高于孢子体样品(P0.01),说明配子体样品中细菌群落丰度大于孢子体;Shannon 和 Simpson 指数用于衡量物种多样性(Grice et al,2009),受群
19、落中物种丰富度和物种均匀度影响,在物种丰度相同的情况下,群落中各物种均匀度越大,群落的多样性越大,配子体的 Shannon 和 Simpson 指数显著大于孢子体(P0.01),说明配子体样品的细菌多样性也大于孢子体(图 2)。图 1 16S rRNA 基因测序的稀释性曲线 Fig.1 Rarefaction curves of 16S rRNA gene sequencing 表 2 细菌群落的 Alpha 多样性指数 Tab.2 Alpha-diversity index of bacterial communities 样品编号Sample ID ACE 指数ACE Chao1指数 Ch
20、ao1香农指数 Shannon 辛普森指数 Simpson覆盖率Coverage/%G1 243.23245.003.41 0.80 99.97 G2 279.44279.754.46 0.90 99.99 G3 274.36275.004.52 0.92 99.97 S1 130.37123.770.21 0.03 99.97 S2 136.90136.130.89 0.20 99.96 S3 119.18114.670.26 0.05 99.97 2.1.3 细菌群落结构相似度分析 通过主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)对裙带菜配子体和孢子
21、体细菌群落结构的相似度进行比较分析。基于Weighted-Unifrac 算法的 Beta 多样性分析结果见图 3,如图 3 所示,孢子体组的 3 个样品明显聚集,与配子体组差异明显,PC1 差异占总变异的 92.00%,PC2差异占总变异的 5.68%。2.1.4 细菌群落组成 裙带菜配子体和孢子体样品的共有 OTU 数目为 145,配子体的独有 OTU 数目为 149,孢子体的独有 OTU 数目为 7。222 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 图 2 配子体与孢子体样品细菌群落的 Alpha 多样性指数比较 Fig.2 Comparisons of alpha-diversity in
22、dex of bacterial communities between gametophytes and sporophytes*代表组间差异显著(P0.01),下同。*indicates significant difference between two groups(P0.01),the same as below.图 3 基于 Weighted-Unifrac 算法的配子体及孢子体 细菌群落 PCoA 分析 Fig.3 PCoA result of bacterial communities in gametophytes and sporophytes based on Weigh
23、ted-Unifrac algorithm 在门水平上,裙带菜附着细菌的主要类别是蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和绿弯菌门(Chloroflexi)(图 4A)。在配子体附着细菌中,变形菌门(66.67%)为第一优势菌门,其次为拟杆菌门(13.48%)、蓝细菌门(11.13%);而在孢子体中,蓝细菌门(95.67%)为第一优势菌门,其次为放线菌门
24、(1.65%)和厚壁菌门(1.48%)。在纲分类水平上,裙带菜附生细菌群落主要由生氧 光 细 菌 纲(Oxyphotobacteria)、-变 形 菌 纲(Alphaproteobacteria)、-变 形 菌 纲、拟 杆 菌 纲(Bacteroidia)、梭 菌 纲(Clostridia)、放 线 菌 纲(Actinobacteria)和芽孢杆菌纲(Bacilli)组成(图 4B)。在配子体表面细菌群落中,-变形菌纲(34.58%)为第一优势菌纲,其次为-变形菌纲(31.01%)、拟杆菌纲第 5 期 李昱倩等:裙带菜配子体与孢子体的附生微生物群落组成分析 223 (13.16%)、生氧光细菌
25、纲(11.13%);而在所取的孢子体样品中,生氧光细菌纲(95.67%)为第一优势菌纲,其次为放线菌纲(1.64%)、芽孢杆菌纲(0.92%)、-变形菌纲(0.90%)。生氧光细菌纲、-变形菌纲、拟杆菌纲、-变形菌纲、Negativicutes、OM190、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)10 个纲的丰度在裙带菜配子体和孢子体样品之间存在显著差异(P0.05),其中,OM190、酸微菌纲和浮霉菌纲是配子体独有。图 4 门(A)和纲(B)分类水平细菌
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