四川某猪场猪链球菌2型菌株的分离鉴定与耐药性分析.pdf
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1、202307期 总第400期本研究对四川某猪场环境及发病猪进行样品采集,对样品进行细菌分离纯化,纯化菌株经PCR鉴定,确定为猪链球菌2型致病菌株。随后通过纸片扩散法和最小抑菌浓度(MIC)值测定对药物敏感性进行分析,为该养殖场及周边猪场提供用药指导。1材料与方法1.1主要仪器和试剂全自动核酸提取仪购自西安天隆科技有限公司,PCR仪购自美国伯乐公司。THB(Todd-Hewitt Broth)培养基、无菌脱纤维绵羊血、革兰染色液试剂盒、多粘菌素B、萘啶酮酸购自青岛海博生物有限公司;溶菌酶、溶菌酶缓冲液购于天根生化科技(北京)有限公司;PCR mix混合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;药敏纸
2、片购自杭州微生物试剂有限公司;DNA核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司;革兰阳性需氧菌药敏检测板购自上海星佰生物技术有限公司;猪链球菌2型阳性对照菌株由四川省动物疫病预防控制中心实验室保存。1.2样品采集对四川某猪场发病死亡生猪的圈舍按照“五点混一”方式采集环境样品11份,对同圈有跛行等明显发病症状的生猪采集唾液样品18份,合计29份样品。取样品10L加入1mL选择性THB液体培养基(含15g/mL多粘菌试验研究四川某猪场猪链球菌2型菌株的分离鉴定与耐药性分析张孟思,陈斌,刘珈均,张毅,阳爱国,邵靓*(四川省动物疫病预防控制中心,四川 成都 610041)摘要:本研究采集某发病猪场的环境及
3、病猪样品,通过细菌分离纯化、PCR鉴定为猪链球菌2型致病菌株,随后用纸片扩散法测定该菌株的耐药性,结果显示对青霉素类、头孢类(头孢噻呋)、喹诺酮类、糖肽类、氨基糖苷类、多肽类最为敏感,对头孢类(头孢西丁)、氯霉素类较为敏感,对磺胺类、碳青霉烯类(亚胺培南)、四环素类、大环内酯类耐药。选取敏感的10种药物进行最小抑菌浓度(MIC)值测定,结果显示:阿莫西林的MIC为8g/mL,苯唑西林、头孢噻呋、氧氟沙星、万古霉素和庆大霉素的MIC为4g/mL,恩诺沙星和恩拉霉素的MIC为1g/mL。关键词:猪链球菌2型;分离鉴定;药敏试验;耐药性中图分类号:S858.285.1文献标识码:B文章编号:1001
4、-8964(2023)07-0032-04收稿日期:2022-12-26基金项目:四川省科技计划项目资助(2020YFN0034)作者简介:张孟思(1993),女,四川自贡人,硕士,研究方向:动物疫病防控、动物传染病病原分子生物学。*通信作者:邵靓(1985-),女,四川成都人,博士,正高级兽医师,研究方向:动物疫病防控、动物传染病病原分子生物学。32202307期 总第400期素B,30g/mL萘啶酮酸)中混匀,37 180r/min培养16h。将菌液划线接种于选择性绵羊血THB平板(含15 g/mL 多粘菌素B,30 g/mL萘啶酮酸),并置于37培养箱中静置培养过夜。1.3分离纯化挑取可
5、疑菌落划线接种于绵羊血THB平板,37 培养过夜后进行革兰染色镜检,将疑似猪链球菌的单菌落接种于选择性THB液体培养基,37 180r/min培养16h1。1.4菌种鉴定次日,将菌液以1000r/min离心1min,弃上清,于菌体沉淀中加入70L溶菌酶和110L溶菌酶缓冲液,混匀,37作用30min。预处理后使用DNA核酸提取试剂盒提取菌液全基因组,并以此为模板,采用 GB/T 19915.9-2005猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法 中特异性基因Sly为引物(Sly1:CCCAAGTTCAAGCCGCATTTA;Sly2:GAAGATTGCGAGCATTTCCTG)进行PCR扩增,扩增程
6、序为:95 3 min;95 15 s,55 20 s,72 40 min,40个循环;72 5 min。随后用16S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增程序为:94 5min;94 1min,55 30s,721.5 min,30个循环;72 10 min。PCR产物送上海生工生物公司测序,测序结果在GenBank上进行Blast比对。1.5耐药性测定采用K-B纸片扩散法对分离菌株的耐药性进行初步测定。选取纯化培养单菌落接种于THB液体培养基,37过夜培养至细菌浓度达到约1108CFU/mL。用无菌涂布棒蘸取培养好的菌液均匀涂布于THB平板上,静置数分钟,再用无菌镊子将阿莫西林、苯唑西林等
7、16种药物(表1)的药敏纸片均匀间隔贴于培养基表面,轻压纸片使之接触良好,37恒温培养24h。共做 3 个重复,测定 3 组抑菌圈直径并取平均值。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准判定细菌对各药物的敏感性2。1.6MIC值测定采用抗生素最低抑菌浓度(MIC)测定法对分离菌株进行耐药性检测。按照革兰阳性需氧菌药敏检测板使用说明,挑取纯培养的菌落 23个,置于23 mL灭菌生理盐水中,将菌液浓度调整至1.5108CFU/mL左右,用营养肉汤培养液将菌液稀释200倍,吸取稀释液100L加入96孔微量药敏板条,将板条放入37 恒温培养箱中培养1820h后读取结果。2结果2.1镜检结果试验中
8、分离到的菌株在THB绵羊血平板上出现不太明显的溶血,菌落呈圆形、灰白色、针尖大小的露珠状,表面光滑、中央隆起、边缘整齐。挑取可疑菌落进行革兰染色镜检,光学显微镜下可见革兰染色阳性,圆形或卵圆形菌体,成双或成短链状排列。2.2PCR 鉴定结果以猪链球菌2型特异性基因Sly为引物进行PCR扩增,扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图1和图2。阴性和阳性对照成立,11份环境样品中阳性条带有10条,大小495 bp,与预期一致,阳性率90.90%;18份生猪唾液样品中阳性条带有9条,大小495bp,与预期一致,阳性率50.00%。同时,为了保证试验结果可靠性,用 16S rRNA 基因试验研究抗生素
9、类别青霉素类头孢类磺胺类碳青霉烯类喹诺酮类糖肽类氨基糖苷类多肽类四环素类大环内酯类氯霉素类药物名称阿莫西林、苯唑西林头孢噻呋、头孢西丁复方新诺明、磺胺嘧啶亚胺培南恩诺沙星、氧氟沙星万古霉素庆大霉素恩拉霉素多西环素红霉素、克拉霉素氟苯尼考表1试验所选用的抗生素药敏纸片M1234567891011图1环境样品中Sly基因PCR扩增电泳图33202307期 总第400期PCR 产物测序并进行比对,结果表明该序列与NCBI上猪链球菌2型的16S rRNA基因序列的同源性达到99%,由此进一步确定此分离株为猪链球菌2型。2.3药敏试验结果药敏试验结见表2。分离菌株对青霉素类(阿莫西林和苯唑西林)、头孢类
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