翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)miR-133a-5p的时空表达特征及饥饿对其节律性表达的影响.pdf
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1、为了解翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)miR-133a-5p 的时空表达规律以及短期饥饿对其昼夜节律性表达的影响,本研究利用实时荧光定量 PCR 检测了 miR-133a-5p 在翘嘴鳜不同组织、不同胚胎发育阶段的表达谱,以及短期饥饿后 miR-133a-5p 昼夜节律的表达特征。结果显示,miR-133a-5p 在红肌中表达最高,在白肌和心肌组织中表达较高,在其他组织中的表达较低;miR-133a-5p 在胚胎发育的 2 细胞期就有较高表达,随着胚胎的发育其表达量逐渐降低,从囊胚晚期开始直至出膜期,其表达均维持在一个较低的水平,且各阶段的表达无显著性差异;miR-133a-5p
2、在正常投喂的翘嘴鳜白肌中的表达没有明显的昼夜节律性,而在饥饿 5 d 后其表达呈现昼高夜低的节律性。本研究结果表明,miR-133a-5p 在翘嘴鳜肌源性组织中高表达,推测其在肌肉组织中有重要作用;miR-133a-5p 呈母源性高表达,推测其调控的靶基因可能抑制胚胎早期的发育;miR-133a-5p 在饥饿 5 d后呈节律性表达,提示其可能通过调节生物节律参与饥饿胁迫下的适应性调控。关键词:miR-133a-5p;翘嘴鳜;表达特征;短期饥饿;昼夜节律中图分类号:Q752,S917.4文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)04-0283-07Spatio-temporal Ex
3、pression Characteristics of miR-133a-5p andEffect of Fasting on Its Rhythmic Expression in Siniperca chuatsiXIE Min1,2,DING Ying1,RU Hui1,QIN Jiaxin1,HE Yazhi1,YI Qiaoru1,LIAO Xin1,CHU Wuying1,ZHU Xin1*(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Nutrition and Quality Control of Aquatic Animals,Department
4、of Biological andChemical Engineering,Changsha University,Changsha 410022,Hunan,China;2.Hunan Fisheries Science Institute,Changsha410022,Hunan,China)Abstract:To understand the spatio-temporal expression pattern of miR-133a-5p and the effect of short-term fasting on circadian rhythm of its expression
5、 in Siniperca chuatsi,real-time fluorescence quantitativePCR was used to detect the miR-133a-5p expression in different tissues and embryonic developmentalstages and its circadian rhythm after short-term fasting.The results showed that the expression of miR-133a-5p was highest in slow-twitch muscles
6、,higher in fast-twitch muscles and myocardium,but lower inother tissues.The expression level of miR-133a-5p was high at the two-cell stage during embryonic develop-ment,and gradually decreased with the development of the embryo.It maintained at a low level from thelate blastula stage to the hatching
7、 larvae with no significant difference between each stage.The expression ofmiR-133a-5p showed no obvious circadian rhythm in fast-twitch muscles of normally fed S.chuatsi,but a第 27 卷 第 4 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援4圆园23 年 8 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Aug.圆园23窑 非编码 RNA 专栏 窑生命科学研究圆园23 年翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是真鲈科鳜属鱼类
8、,又称桂鱼、季花鱼等,属于淡水名贵经济鱼类。翘嘴鳜肉质细嫩且易消化,具有高优质蛋白质、低脂肪等特点,因此有较高的经济价值1。肌肉组织既是鱼类的主要结构组织,也是人类食用的主要部位,同时其功能正常对机体能量代谢平衡和健康具有重要意义2。目前,翘嘴鳜肌肉生长和生理特性的分子调控机制尚未完全阐明,有待进一步的研究来揭示。微 RNA(microRNA,miRNA)是一类内生的、长度为 2024 个核苷酸的非编码小 RNA。近年来的研究显示,miRNA 可调节脂质和糖等物质的代谢3-4,对体内代谢平衡有至关重要的作用,但其作用机制和调控方式,尤其在经济鱼类中,还有待深入研究。miRNA 的调控是一个复杂
9、的网络调控过程,一个 miRNA 可以调控多个靶基因的表达,或者几个 miRNA 通过组合来精细地调控某个基因的表达5-6。在动物体内,miRNA 与靶基因 mRNA 3忆非翻译区(3忆-untranslated region,3忆-UTR)不完全碱基配对,抑制靶基因 mRNA 翻译或者促进靶基因 mRNA 降解。研究显示,一系列与肌肉增殖、生长分化相关的 miRNA 在肌肉组织中呈现高水平表达,被称为肌肉特异性 miRNA,其中 miR-133 是对肌肉组织中的基因表达影响最大的肌肉特异性miRNA之一7-8。miR-133 家族有miR-133a和 miR-133b 两个成员,其中 miR
10、-133a 在肌肉组织中有较高表达,其在肌细胞分化过程中被诱导,能指导成肌细胞分化为成熟的肌管9-10。目前,关于 miR-133a在经济鱼类中的表达特征以及功能的研究较少。昼夜节律是生物体各种生理机能适应外界环境昼夜变化而建立起的规律周期,又称近日节律,是机体行为、生理和生化呈近似 24 h 周期性的变化规律。昼夜节律与生理周期的脑波活动、激素生产、细胞再生及其他生理活性模式相关联,在所有动物确定睡眠和进食模式中起重要作用11。节律性振荡不仅存在于生物节律中枢,也存在于外周器官、组织及细胞,其产生依赖于节律基因转录、转录后及翻译后水平调控。miRNA 作为基因表达的调控因子,能够直接靶向节律
11、基因或其他基因,从而调控外周生物节律12。相关研究报道,在翘嘴鳜红肌及白肌组织中有 21 个 miRNA 具有显著的昼夜节律性13,表明 miRNA 可能参与调控翘嘴鳜红肌和白肌生理功能的节律性。外界环境因子(包括营养限制)会影响生物体昼夜节律的表达,能使节律重新设置14。由于季节更替或环境剧变以及食物分布在空间上的不均匀等因素,鱼类经常会在生活周期的一定阶段面临食物资源缺乏,从而受到饥饿胁迫14。受到饥饿胁迫的鱼类可通过调动体内不同器官的储能物质,调节自身的能量分配,降低代谢水平,以适应食物的缺乏15-16。在人工饲养条件下,由于饵料分配不均或者个体之间争夺,部分翘嘴鳜也很可能会受到饥饿胁迫
12、。前期研究显示,在饥饿复投喂处理的翘嘴鳜中,一些 miRNA 对营养变化能快速应答17,说明 miRNA 参与翘嘴鳜饥饿胁迫下的适应性调控,但其具体的功能及机制尚不明确。本研究聚焦 miR-133a-5p 在翘嘴鳜的时空表达谱及饥饿胁迫下的节律表达特征,以期为揭示 miR-133a-5p 的功能及饥饿胁迫下的适应性调控机制提供基础资料。1材料与方法1.1实验材料翘嘴鳜人工繁殖实验亲鱼来自于湖南水产科学研究所鳜鱼原种场,用于组织表达谱研究以及饥饿实验的翘嘴鳜购自湖南省长沙市望城区团山湖村绿康之星鳜鱼养殖场。1.2实验方法1.2.1翘嘴鳜不同发育阶段胚胎的收集翘嘴鳜的人工繁殖与胚胎孵化培养等操作技
13、circadian rhythm appeared after 5 days of fasting,with high expression during the day and low at night.Takentogether,miR-133a-5p was specifically highly expressed in muscle related tissues,suggesting that it mayplay an important role in the muscular tissue.Its high expression during embryonic develo
14、pment revealedthat the target genes regulated by miR-133a-5p may inhibit early embryonic development of S.chuatsi.Therhythmic expression of miR-133a-5p after fasting indicated that miR-133a-5p may be involved in theadaptive regulation of S.chuatsi muscles in response to fasting stress by regulating
15、biological rhythm.Key words:miR-133a-5p;Siniperca chuatsi;expression pattern;short-term fasting;circadian rhythm(Life Science Research,2023,27(4):283-289)284第 4 期谢敏等:翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)miR-133a-5p 的时空表达特征及饥饿对其节律性表达的影响术参考刘希良等18的研究方法。待胚胎发育至 2细胞期(2-cell,1 h)、32 细胞期(32-cell,2.5 h)、囊胚早期(early-blastula
16、,5 h)、囊胚晚期(late-blastula,7 h)、原肠早期(early-gastrula,12 h)、原肠晚期(late-gastrula,17 h)、神经胚期(neurula,18 h)、视泡期(optic vesicle,20 h)、尾芽期(tail bud,23 h)、肌效期(muscular effect,38 h)、心搏期(heart beating,41 h)和出膜期(hatching larvae,58 h),分别取 30 枚胚胎保存于装有 1 mL Trizol 试剂的离心管中,然后立即置于-80 益超低温冰箱内备用。1.2.2翘嘴鳜短期饥饿处理及组织样品的收集挑选健
17、康无病、体重相近的翘嘴鳜(145 g依12 g)114 尾,所有翘嘴鳜先采用 12 h 光照、12 h 黑暗的 LD(light-dark)光制进行 30 d 的驯养试验。随机挑选 6 尾翘嘴鳜用于组织表达谱研究,在冰上分别取其心(heart)、肝(liver)、脾(spleen)、肠(gut)、肾(kidney)、近尾部侧线处红肌(slow-twitch muscle)以及背部(dorsal)、腹部(ventral)和尾部(tail)白肌(fast-twitch muscle)组织,置于液氮快速冷冻后保存于-80 益超低温冰箱备用。将剩余的翘嘴鳜随机分为正常投喂组和饥饿组,每组 54 尾,饥
18、饿组经饥饿处理 5 d。正常投喂组和饥饿组的采样时间均设置在一昼夜的 9 个时间点,即 06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00、24:00、次日的 03:00 和 06:00,它们分别对应区时(zone time,ZT)ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21 和 ZT24。每个采样时间点随机选 6 尾鱼,取背部白肌,用液氮快速冷冻,随后保存于-80 益超低温冰箱内备用。1.2.3RNA 提取及 cDNA 合成胚胎样品和组织样品的总 RNA 使用 Trizol法提取RNAiso Plus,宝日医生物技术(北京)有限公司,用核酸检测仪
19、与琼脂糖凝胶电泳测定其浓度和纯度。cDNA 合成使用 One Step PrimeScript誖miRNA cDNA Synthesis Kit 宝日医生物技术(北京)有限公司。多腺苷酸polyadenylic acid,poly(A)加尾反应与 cDNA 合成反应同步进行,反应程序为 37 益、60 min poly(A)加尾和反转录反应;85 益、5 s(酶的失活反应)。1.2.4引物设计与合成根据本实验室前期鉴定的翘嘴鳜 miRNA 数据库19,设计 miR-133a-5p 荧光定量 PCR 引物,以RPL13 基因作为荧光定量的内参基因19-20。引物通过 Primer 5.0 软件设
20、计,具体序列见表 1,设计后由北京擎科生物科技有限公司合成。1.2.5荧光定量 PCR在荧光定量 PCR 仪上进行反应,反应总体系为 12.5 滋L,包括 SYBR Premix Ex TaqTM域 6 滋L、逆转录得到的 cDNA 1 滋L、灭菌纯水 4.5 滋L、上游引物和下游引物各 0.5 滋L。反应程序:95 益预变性 3 min,95 益变性 5 s,60 益退火和延伸 20 s,39 个循环。每组反应设 3 个技术重复。1.2.6数据处理荧光定量 PCR 数据利用 2-驻驻Ct法计算目的基因的相对表达量21。各组相对表达量数据用 SPSS16.0 软件进行单因素方差分析,数据结果表
21、示为平均值依标准误(x依sx),当 P0.05 时两组数据之间存在显著差异22。miR-133a-5p 在翘嘴鳜白肌的昼夜节律性表达数据经显著性分析后,采用 MATLAB 软件进行余弦曲线拟合,方程式为 f(t)=M+Acos(t仔/12-渍)。式中,f(t)表示给定时间内基因的表达水平;t 表示以小时为单位的给定时间;M 表示各时间点基因表达的平均值;A 代表振荡振幅;渍 表示峰值相位,是最高振幅所在时间点所换算出的角度。当显著性差异 P0.05,MATLAB 输出 P0.3 时,该基因具有昼夜节律性23。2结果与分析2.1miR-133a-5p在翘嘴鳜不同组织的表达分析为了解 miR-13
22、3a-5p 在翘嘴鳜不同组织的表达分布情况,利用荧光定量 PCR 检测了 miR-133a-5p 在心、肝和白肌等 7 个组织的相对表达水平。如图 1 所示,miR-133a-5p 在红肌的表达量最高,在心脏和白肌的表达次之,其中在背部、腹部和尾部白肌之间的表达无显著性差异,而且在肝、脾、肾和肠都只检测到少量的表达,这表明表 1荧光定量 PCR 引物序列Table 1The primers for real-time fluorescence quantitative PCRPrimermiR-133a-5p-FRPL13-RT-F1RPL13-RT-R1Sequence(5忆-3忆)CGAG
23、CTGGTAAAATGGAACCCACAAGAAGGAGAAGGCTCGGGTTTTGGCTCTCTTGGCACGGATAnnealing temperature/益5858Amplification efficiency/(%)97.498.6285生命科学研究圆园23 年miR-133a-5p 主要在肌源性组织中高表达。2.2miR-133a-5p 在翘嘴鳜胚胎不同发育阶段的表达分析为了解 miR-133a-5p 在翘嘴鳜不同胚胎发育阶段的表达情况,利用荧光定量 PCR 检测了miR-133a-5p 在 2 细胞期(受精 1 h)、32 细胞期(2.5 h)、囊胚早期(5 h)、囊胚晚期(
24、7 h)、原肠早期(12 h)、原肠晚期(17 h)、神经胚期(18 h)、视泡期(20 h)、尾芽期(23 h)、肌效期(38 h)、心搏期(41 h)和出膜期(58 h)的相对表达水平。如图 2 所示,miR-133a-5p 在翘嘴鳜胚胎的 2 细胞期就有表达,且此时的表达量最高,说明 miR-133a-5p 的表达具有母源性;随后,32 细胞期至囊胚早期的表达量显著降低;而且,随着胚胎的发育,miR-133a-5p的表达量进一步降低,从囊胚晚期至出膜期其表达均维持在一个较低的水平,且各发育阶段的表达无明显差异。2.3饥饿 5 d 后 miR-133a-5p 的昼夜节律性表达分析为确定 m
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