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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起斑马鱼肠道生理损伤和肠道菌群失调.pdf
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1、研究分析了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染斑马鱼后肠道生理健康和肠道微生物的变化。以斑马鱼为研究对象,刮伤皮下真皮,使用 105 CFU/mL 浓度的嗜水气单胞菌暴露 6 h 后转入清水,分别在暴露前、暴露后 6 h、12 h、24 h 取样。使用鱼特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,检测肠道中紧密连接蛋白 ZO-2(TJP2)含量和乙氧基异戊二烯-O-脱乙基酶(EROD)酶活性,结果表明,嗜水气单胞菌暴露引起了斑马鱼肠道生理损伤,表现为肠道 TJP2 含量、EROD 酶活性在暴露后显著下调。采用 16S rRNA 高通量测序检测肠道微生物及其菌群结构变化,
2、嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后致病菌不动杆菌属(Acinetobacter)明显增加,OTUs 数量明显下降,Alpha 多样性降低,结果说明嗜水气单胞菌引起了斑马鱼肠道菌群失调。肠道中微生物的多样性与改善肠道上皮和黏膜屏障功能紧密相关,该研究对从肠道健康的角度评价嗜水气单胞菌毒性,探索嗜水气单胞菌的致病机制具有重要意义。关键词 嗜水气单胞菌;斑马鱼;肠道微生物;Alpha 多样性;TJP2 中图分类号 S917.1 doi:10.11693/hyhz20221000254 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)在自然界中分布广泛,是一种典型的人鱼共患病的条件致病菌,感染致病性嗜水
3、气单胞菌可导致人腹泻、食物中毒和继发感染(杨守明等,2006)。嗜水气单胞菌感染鱼 类 种 类 众 多,可 以 引 起 罗 非 鱼(Oreochromis mossambicus)、鲶鱼(Silurus asotus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等鱼类细菌性败血症,其致死率高、流行广,严重制约了中国水产养殖业的发展(Jones et al,1995;Da Silva et al,2012;Prayitno et al,2021;Chen et al,2022)。因此,研究嗜水气单胞菌对鱼类的致病性特征及其可能的致病机理,对渔业生产具有重要意义。气单胞菌的致病性与环境的变化(温度变化
4、、含氧量降低、氨氮升高)有关(白晓倩,2016;孟令杰,2017;孙元琛等,2022)。目前有研究表明,气单胞菌感染的同时往往存在混合感染的情况(聂慧慧,2016),肠道微生物存在的共生菌通过竞争营养物质和肠黏膜的附着点即生态位来抑制病原菌的生长增殖(查继伟,2019)。有研究表明,芽孢杆菌益生菌添加在饲料中,能够增加中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌致病菌的抵抗力(陈文典,2009),气单胞菌与其他细菌存在相互作用,而它的致病性可能依赖于肠道菌群的组成(查继伟,2019)。肠道是机体一种重要的免疫器官,其中,肠道微生物与肠道黏膜间的交流和免疫系统密切相关(徐绍刚等,2019),但目前人们对肠道微生物与
5、肠道黏膜屏障的调控机制研究仍在初级阶段。稳定的肠道微生物区系影响着宿主的多种功能,在宿主的生长发育、营养、食物消化、免疫反应以及抵抗病原菌等方面发挥了重要作用(郭军等,2019;盛鹏程等,2020)。研究嗜水气单胞菌对鱼类肠道黏膜屏障及肠1192 海 洋 与 湖 沼 54卷 道微生物的影响,对评价嗜水气单胞菌毒性,以及从肠道健康的角度,探索嗜水气单胞菌的致病机制具有重要意义。斑马鱼因其体型小、生长快、完备的遗传系统和基因组资源,已成为脊椎动物发育和人类疾病的重要模型(Neely et al,2002)。本研究使用嗜水气单胞菌暴露成年斑马鱼后,采用 ELISA 和 16S rRNA 高通量测序,
6、检测斑马鱼肠道生理指标及肠道微生物的变化,评价嗜水气单胞菌对肠道健康的影响,探索嗜水气单胞菌可能的毒性机制。1 材料与方法 1.1 材料 嗜水气单胞菌(J5L09)来源于合肥养殖基地的患细菌性败血症异育银鲫(Carassius auratus gibelio)体内分离并保存于实验室。实验所用的 4 月龄成年斑马鱼(Danio rerio,AB 株),从中国科学院水生生物研究所的斑马鱼育种中心(武汉,中国)购买,在安徽省农业科学院水产研究所进行室内循环水养殖实验。1.2 养殖及暴露实验 成年斑马鱼的养殖依据 Yu 等(2010)提出的养殖方案进行。养殖过程中保持水温在(280.5)C,光暗周期为
7、 14 h:10 h,每日喂食丰年虫两次。4 月龄成年斑马鱼暂养 14 d 无死亡后开始暴露实验。麻醉后,用无菌手术刀沿胸鳍后方侧面刮除几片鳞片,并刮伤皮下真皮。麻醉恢复后用(105 CFU/mL)嗜水气单胞菌浸泡 6 h 后转入清水中,分别在暴露前和暴露后 6 h、12 h、24 h 时进行取样。1.3 肠道采集 取样前需禁食 24 h,用 0.03%的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)对斑马鱼进行麻醉,MS-222 是一种经过美国食品与药物管理局(FDA)认可的渔用麻醉剂,且对人体和水产品没有副作用。麻醉后使用无菌的剪刀和镊子解剖,取得的斑马鱼肠道放在无菌的 EP 管中。随后立即使用
8、液氮冷冻,放置在80 C,用于后续提取 DNA。1.4 肠道生理指标的测定 把 5 条肠道混作一个样,加入 9 倍组织体积的生理盐水。匀浆研磨充分后在 3 000 r/min 离心 15 min,取上清液。使用紧密连接蛋白 ZO-2(TJP2)和乙氧基异戊二烯-O-脱乙基酶(EROD)的鱼特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒,按照说明书检测肠道中 TJP2含量和 EROD 活性,试剂盒购买于南京建成。1.5 肠道微生物群落总 DNA 提取 把 10 条肠道混作一个样,向每管样品加入 1 mL裂解液,在 37 C 下水浴 30 min,加入蛋白酶 K(100 g/mL),随后 55 C 水
9、浴下裂解 12 h,在室温下恢复温度后,离心取其上清液,再进行抽提纯化,用氯化钠(0.1 倍体积)和无水乙醇(2 倍体积)沉淀 DNA,3 h 后用 70%乙醇清洗 DNA 沉淀,将 DNA 干燥后溶解于 40 L TE,回收得到的 DNA 进行测序分析。1.6 16S rRNA 高通量测序和分析 提取好的肠道菌群 DNA 用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度,以肠道细菌 DNA 为模板,采用通用引物 341F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增出细菌16S DNA 序列。在进行数据处理过滤时(Fadrosh et al,201
10、4),使用内部撰写的程序对原始的测序数据进行处理,基于 OUT(Operational Taxonomic Units)聚类的 Vsearch 方法进行序列拼接,质量过滤,去重,聚类(Rognes et al,2016)。使用朴素贝叶斯(Naive Bayes)分类器完成注释,根据注释结果统计各样本在不同分类水平中的分类单元数量(唐亚鹏等,2022)。2 结果与分析 2.1 嗜水气单胞菌暴露对斑马鱼肠道生理的影响 2.1.1 肠道中 TJP2 的含量 对暴露前后肠道中紧密连接蛋白 TJP2 的含量进行检测,结果如图 1,在嗜水气单胞菌暴露斑马鱼 12 h 和 24 h 后,肠道中 TJP2的含
11、量显著降低(P0.05,P0.01)。2.1.2 肠道中 EROD 酶活 检测暴露前后肠道中EROD活性,代表解毒能力的 EROD 活性随暴露时间 图 1 斑马鱼肠道中 TJP2 的含量 Fig.1 TJP2 content in the intestinal tract of zebrafish 注:0 表示未暴露前的斑马鱼肠道样本,6、12、24 表示暴露后 6 h、12 h、24 h 的肠道样本。数据表示平均值标准误差(meanSEM)。*P0.05 表示暴露组相对于未暴露组具有显著差异,*P0.01 表示暴露组相对于未暴露组具有显著差异具有极显著差异。下同 4 期 孙 雯等:嗜水气单胞
12、菌(Aeromonas hydrophila)引起斑马鱼肠道生理损伤和肠道菌群失调 1193 图 2 斑马鱼肠道中 EROD 的活性 Fig.2 EROD activity in the intestinal tract of zebrafish 的增加而降低,在嗜水气单胞菌暴露 24 h 后,斑马鱼肠道中 EROD 的活性显著降低(P0.01)。2.2 嗜水气单胞菌暴露对斑马鱼肠道微生物的影响 2.2.1 样本数据统计和测序质量分析 高通量测序后,如表 1 所示,共获得有效序列条数为 475 434条。把序列按照随机抽样的方法,通过测序数据量以及 OTU 数量构建稀释曲线,可见图 3 中各样
13、本的曲线趋于平缓,说明测序的数据量合理,目前的 OTU数量可以代表各组的微生物信息。表 1 各样本数据信息统计 Tab.1 Statistics of the sample data 样本 序列条数/条 序列碱基数/个 序列平均长度/bpA1 41 142 17 095 074 415.51 A2 43 262 17 887 195 413.46 A3 48 064 19 964 359 415.37 B1 41 347 16 957 275 410.12 B2 33 839 14 012 151 414.08 B3 45 051 18 749 575 416.19 C1 38 236 15
14、895 941 415.73 C2 46 737 19 544 416 418.18 C3 30 152 12 493 168 414.34 D1 33 764 14 052 305 416.19 D2 43 831 18 322 347 418.02 D3 30 009 12 525 538 417.39 注:A、B、C、D 组分别为暴露前和暴露后 6 h、12 h、24 h 的肠道样本,每组分别设置 3 个平行 2.2.2 基于 OTU 的 VENN 图 VENN 图显示样本中共有和独有 OTU 数目,表明样品 OTU 数目的组成相似性和重叠情况,OTU的丰度能够初步体现样品的物种丰富程度
15、。如图 4 所示,未暴露前,斑马鱼肠道细菌获得OTU 368个,在暴露后6 h、12 h、24 h后,斑马鱼肠道细菌分别获得 OTU 246、253 个、226 个。图 3 物种数目饱和度稀释曲线 Fig.3 Curve of the species-number saturation dilution of the samples 注:A 组为未暴露前斑马鱼肠道样本,B、C、D 组分别为暴露后 6 h、12 h、24 h 的肠道样本 图 4 基于 OTU 的 VENN 图 Fig.4 The Venn diagram of the OTU distribution 2.2.3 肠道菌群的 A
16、lpha 多样性 Alpha 多样性是对单个样品中物种多样性的分析(Schloss et al,2009),反映样品中群落的丰富度和物种均匀度。包括 ACE指数、Chao 指数和 Richness 指数等。它们的指数越大,说明样品中的物种越丰富。相比未暴露嗜水气单胞菌的对照组,在暴露 6 h、12 h、24 h 后,暴露组的Alpha 多样性显著降低(图 5)。2.2.4 Rank曲线 Rank 曲线能够展现样品的物种多样性,也能够反映物种的均匀程度和丰富程度。样品曲线越宽表示样品中物种组成越丰富,样品曲线越平坦表示样品中物种组成的均匀度越高。由此可见,暴露嗜水气单胞菌后,斑马鱼样品中物种组成
17、丰富度降低(图 6)。1194 海 洋 与 湖 沼 54卷 图 5 Alpha 多样性指数 Fig.5 The Alpha diversity index 图 6 基于 OTU 的 Rank 曲线 Fig.6 The rank-abundance of the OTU distribution 2.2.5 门和属水平物种丰度 如图7所示,在门水平上,对照组肠道菌群中,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)占主导地位,但相对丰度不同。其中,变形菌门所占比例为 36.87%,拟杆菌门所占比例为 36.11%,放线
18、菌门所占比例为 26.53%。值得注意的是,在嗜水气单胞菌暴露斑马鱼 12 h 和 24 h 后,放线菌门所占比例分别降低了 28.95%和 17.75%。图 7 在门水平上的肠道菌群群落结构柱状图 Fig.7 Histogram of community structure of the intestinal flora at phylum level 在属水平上(图 8),与对照组相比,暴露 6 h、12 h、24 h 后,肠道菌群中 Reyranella 显著降低(P 0.05,P0.05,P0.05),分枝杆菌属(Mycobacterium)在暴露 12 h、24 h 后显著降低(P0
19、.05,P0.05),肠道菌群中的不动杆菌属(Acinetobacter)在暴露 24 h 后也明显增加。2.2.6 主成分分析(PCA)采用无参数多变量方差分析,比较样本的群落组成。图 9 的结果显示,在 图 8 在属水平上的肠道菌群群落结构柱状图 Fig.8 Histogram of community structure of the intestinal flora at genus level 4 期 孙 雯等:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起斑马鱼肠道生理损伤和肠道菌群失调 1195 图 9 斑马鱼肠道菌群的主成分分析 Fig.9 Principal c
20、omponent analysis of intestinal flora in zebrafish 注:图中点分别表示各个样品。不同颜色代表样品属于不同的分组。A 组为未暴露前斑马鱼肠道样本,B、C、D 组分别为暴露后 6 h、12 h、24 h 的肠道样本 暴露嗜水气单胞菌 12 h、24 h 之后,斑马鱼肠道菌群的相似度发生了偏移,样品在 OTU 水平上的群落组成存在差异。3 讨论 肠道是消化和吸收营养的主要器官,其完整性对鱼类的健康至关重要(Jutfelt et al,2007)。肠黏膜屏障功能的损伤与多种肠道疾病的发生密切相关(关玮,2011),紧密连接(tight junction
21、,TJ)蛋白是肠上皮屏障的关键成分(Chasiotis et al,2012),TJP2 是最重要的TJ 蛋白之一,常被用作肠上皮屏障完整性和通透性的指标(Rhee et al,2009)。本研究中,在暴露嗜水气单胞菌 12 h、24 h 后,斑马鱼肠道中 TJP2 的含量显著降低,这表明,嗜水气单胞菌暴露损伤了肠上皮屏障的完整性,提示了嗜水气单胞菌对肠道功能有潜在的干扰作用。有研究表明,感染嗜水气单胞菌的斑马鱼,肠道组织切片上可观察到有明显的肠道上皮损伤,肠道上皮结构被破坏,表现为上皮细胞脱落,缘状纹减少(Wang et al,2016)。嗜水气单胞菌可导致鲤鱼肠道黏膜屏障损伤(Jung-S
22、chroers et al,2018)。嗜水气单胞菌引起的金钱鱼(Scatophagus argus)细菌性疾病的发病金钱鱼,与正常的金钱鱼相比,其肠绒毛结构消失,肌肉层疏松明显(张庆华等,2016)。本研究中,在暴露嗜水气单胞菌 24 h 后,斑马鱼肠道中 EROD 活性显著降低。EROD 活性变化能够反映机体解毒代谢的能力(肖国强等,2013),是公认的鱼类生物效应标记物(Kammann et al,2005),其活性可以指示暴露损伤(Whyte et al,2000;Jnsson et al,2003)。研究表明,成年斑马鱼中,暴露于 50 mg/L 对羟基苯甲酸甲酯(Methylpar
23、aben)会导致 EROD 活性显著降低(De Carvalho Penha et al,2021)。最高温度导致暴露于除草剂丁硫脲(Butylthiourea)的美国牛蛙蝌蚪肝脏中 EROD 活性降低(Grott et al,2021)。将黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)暴露于污染沉积物(低浓度多氯联苯),其 EROD 活性在 140 d 后下降22%(Livingstone et al,1993)。本研究中,暴露后肠道EROD 活性的降低,指示了嗜水气单胞菌对斑马鱼肠道的生理损伤。研究表明鱼类在环境变化后,一些从门到属的OTUs 会在肠道中大量改变(Ada
24、movsky et al,2018)。在本实验中,嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后,肠道菌群中 OTU 数量明显下降。Rank 曲线表明,暴露后组别比暴露前组别分布更窄,物种组成丰富度降低。PCA分析结果显示,暴露改变了斑马鱼肠道菌群的结构。通过 Chao 指数、Richness 指数和 ACE 指数可以看出,与对照组相比,嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后的 Alpha多样性显著降低。很多研究也表明,环境中的有害物质暴露能够导致肠道菌群的改变以及 Alpha 多样性的变化(Chen et al,2018;Qiao et al,2019)。重复损伤导致斑马鱼肠道屏障功能恢复受损,肠道菌群失调(Chuang et
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