生食蔬菜源金黄色葡萄球菌毒素编码基因和药敏性分析.pdf
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1、94 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程生食蔬菜源金黄色葡萄球菌毒素编码 基因和药敏性分析白小宝1,索 佳1,曹晨阳1,苏 丽1,赵越凡1,刘丽莎2,冯承谦3,吕 欣1,杨保伟1,*(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100;2.国家食品安全风险评估中心,北京 100022;3.汉中市汉台区市场监督管理局过街楼蔬菜批发市场监管所,陕西汉中 723000)摘 要:目的:探究零售生食蔬菜中金黄色葡萄球菌分离株携带的毒素基因和药敏性。方法:使用聚合酶链式反应扩增nuc基因,对分离于陕西西安、宝鸡、汉中和延安等地大型超市、农贸市场和摊贩售卖的西红柿、生菜、菠菜
2、和包菜的27 株金黄色葡萄球菌进行鉴定,检测19 种毒素基因和12 种耐药基因在其中的流行情况;使用琼脂稀释法测定其对14 种抗生素的药敏性。结果:共检出17 株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和10 株苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(oxacillin-susceptiblemethicillin-resistantStaphylococcus aureus,OS-MRSA)。共检出8 种毒素编码基因,其中sec检出率最高(29.6%,8/27)。51.9%(14/27)的菌株至少携带1 种毒素编码基因,共检出9 种毒素编码基因谱。共检出blaZ、mecA、ermC、tetK、dfrG、df
3、rK、aac(6)/aph(2”)7 种耐药基因。菌株对苯唑西林、利福平和万古霉素全部敏感,对阿莫西林/克拉维酸耐药最为普遍,其次分别对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、氨苄西林、红霉素、头孢西丁、环丙沙星、头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、四环素和氯霉素耐药。88.9%(24/27)的菌株对3 种及以上抗生素耐药。结论:陕西省生食蔬菜中存在OS-MRSA菌株,具有多重耐药性,携带多种毒素编码基因,对食品安全具有潜在危害。关键词:生食蔬菜;金黄色葡萄球菌;毒素编码基因;药敏性Toxin-Encoding Genes and Drug Susceptibility of Staphylococcus aureu
4、s from Vegetables Consumed RawBAI Xiaobao1,SUO Jia1,CAO Chenyang1,SU Li1,ZHAO Yuefan1,LIU Lisha2,FENG Chengqian3,L Xin1,YANG Baowei1,*(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.China National Center for Food Safety Risk Assessment,Beijing 100022,China
5、;3.Hanzhong City Hantai District Market Supervision Administration Cross Street Vegetable Wholesale Market Supervision Office,Hanzhong 723000,China)Abstract:Objective:Toinvestigatethetoxin-encodinggenesandantibioticsusceptibilityofStaphylococcus aureusisolatesfromretailvegetablesconsumedraw.Methods:
6、The27S.aureus isolatesfromtomato,lettuce,spinachandcabbagecollectedfromsupermarkets,farmersmarketsandvendorsinXian,Baoji,HanzhongandYananofShaanxiprovincewereidentifiedbyPCRamplificationofthenucgene,theprevalenceof19toxin-encodinggenesand12antibioticresistanceencodinggenesintheseisolateswasevaluated
7、,andtheantibioticsusceptibilityto14antibioticswasdeterminedbytheagardilutionmethod.Results:Seventeenoftheseisolateswereidentifiedasmethicillin-susceptibleS.aureus(MSSA)andtheremaining10isolateswereidentifiedasoxacillin-susceptiblemethicillin-resistantS.aureus(OS-MRSA).Atotalofeighttoxin-encodinggene
8、sweredetectedinthe27isolates,andthedetectionrate(29.6%,8/27)of secwashighest.Inaddition,51.9%(14/27)of theseisolatescarriedatleastonetoxin-encodinggene,andninetoxin-encodinggeneprofilesweretotallyidentified.SevenantibioticresistancegenesincludingblaZ,mecA,ermC,tetK,dfrG,dfrK,andaac(6)/aph(2”)weredet
9、ected.Theisolateswereallsusceptibletooxacillin,rifampicinandvancomycin.Resistancetoamoxicillin/clavulanatewasmostcommonlydetected,followedbytrimethoprim/sulfamethoxazole,ampicillin,erythromycin,cefoxitin,ciprofloxacin,ceftriaxone,gentamicin,amikacin,tetracyclineandchloramphenicol.Twenty-four(88.9%)i
10、solateswereresistanttothreeormore收稿日期:2022-08-22基金项目:“十三五”国家重点研发计划重点专项(2017YFC1601400)第一作者简介:白小宝(1998)(ORCID:0000-0002-3310-5218),女,硕士研究生,研究方向为食品安全。E-mail:*通信作者简介:杨保伟(1974)(ORCID:0000-0001-7112-0729),男,教授,博士,研究方向为食品科学。E-mail:生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 95antibiotics.Conclusion:OS-MRSAisprevalentinve
11、getablesconsumedrawinShaanxiprovince,andithasmultipleantibioticresistancesandcarriesmultipletoxin-encodinggens,posingapotentialfoodsafetyhazard.Keywords:vegetablesconsumedraw;Staphylococcus aureus;toxin-encodinggenes;antimicrobialsusceptibilityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220822-256中图分类号:TS201.6 文献标志
12、码:A 文章编号:1002-6630(2023)14-0094-06引文格式:白小宝,索佳,曹晨阳,等.生食蔬菜源金黄色葡萄球菌毒素编码基因和药敏性分析J.食品科学,2023,44(14):94-99.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220822-256.http:/BAI Xiaobao,SUO Jia,CAO Chenyang,et al.Toxin-encoding genes and drug susceptibility of Staphylococcus aureus from vegetables consumed rawJ.Food Science,20
13、23,44(14):94-99.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220822-256.http:/金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌,广泛分布于环境、动物和人体1-2。2016年,金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的食源性疾病暴发事件仅次于副溶血性弧菌和沙门菌3。随着抗生素的长期使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)和苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(oxacilli
14、n-susceptiblemethicillin-resistantStaphylococcus aureus,OS-MRSA)日渐流行,给食品安全带来极大危害4-6。新鲜生食蔬菜可提供人体必需的维生素和矿物质等多种营养,为日常饮食中不可或缺7。此类蔬菜经常以生食为主,进食前往往不经高温烹饪,被金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染后非常容易导致食物中毒8。随着MRSA和OS-MRSA日渐流行,其对食品安全构成的潜在风险日益加剧8-10。目前,针对生食蔬菜中致病菌的研究主要集中于沙门氏菌和大肠杆菌7,对金黄色葡萄球菌污染深入研究较少11-15。本研究对前期分离于陕西4 个城市大型超市、农贸市场和摊贩的西
15、红柿、生菜、菠菜和包菜的金黄色葡萄球菌进行相关研究,旨在为生食蔬菜中金黄色葡萄球菌的安全控制提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌株27 株疑似金黄色葡萄球菌,分离于2020年9月2021年9月在陕西西安、宝鸡、汉中和延安大型超市、农贸市场和摊贩采集的西红柿、生菜、菠菜和包菜。药敏实验质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。1.1.2 试剂LB(Luria-Bertani)琼脂培养基 北京陆桥技术股份有限责任公司;Taq DNA聚合酶、10聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)Buffer、dNTPMixture、MgCl2、DL2000
16、DNAMarker、LoadingBuffer、GelRed 大连宝生物工程有限公司;14 种抗生素 北京索莱宝科技有限公司;引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。1.2 仪器与设备PCR仪、GEL-DOCXR凝胶成像系统 美国伯乐公司;SW-CJ-1CU超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;Milli-QSynthesis超纯水机 德国默克密理博公司;微量移液枪 德国艾本德股份公司;GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;MDF-U5411高压灭菌锅 上海申安高压仪器设备有限公司。1.3 方法1.3.1 PCR模板制备将保存于80 的疑似菌划线接种至LB琼脂平板,37
17、培养过夜后,挑取典型菌落再次划线至LB;挑取12 个菌落,均匀分散于200L无菌去离子水,用煮沸法制DNA模板。1.3.2 nuc、毒素和耐药性编码基因检测使用PCR扩增nuc基因鉴定金黄色葡萄球菌。阳性菌株通过PCR扩增5 种经典肠毒素编码基因sea、seb、sec、sed和see,13 种新型肠毒素编码基因seg、seh、sei、sej、sek、sem、sen、seo、sep、seq、ser、set和seu,杀白细胞毒素编码基因pvl共19 种基因;扩增大环内酯类抗生素耐药性编码基因ermA、ermB、ermC和msrA,四环素耐药编码基因tetK,氨基糖苷类抗生素耐药编码基因aac(6)
18、/aph(2”),甲氧苄啶耐药性编码基因dfrD、dfrK、dfrG和dfrS1(dfrA),-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaZ和mecA等。根据文献16-19报道的序列合成引物。PCR体系为25L,其中10buffer2.5L、MgCl21.5L、dNTP2L、Taq酶0.25L、上游引物0.3L、下游引物0.3L、超纯水13.15L和模板DNA5L。96 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程1.3.3 抗生素药敏性检测采用临床实验室标准化委员会(Clinical andLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)颁布的琼脂稀释法,测定27 株菌
19、对14 种抗生素的敏感性。供试抗生素及其耐药折点分别为:红霉素(erythromycin,ERY;8g/mL)、氨苄西林(ampicillin,AMP;0.5g/mL)、阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin/clavulanicacid,A/C;8/4g/mL)、苯唑西林(oxacillin,OXA;4g/mL)、头孢西丁(cefoxitin,FOX;8g/mL)、环丙沙星(ciprofloxacin,CIP;4g/mL)、利福平(rifampin,RIF;4g/mL)、万古霉素(vancomycin,VAN;16 g/mL)、四环素(tetracycline,TET;16g/mL)、庆
20、大霉素(gentamicin,GEN;16g/mL)、氯霉素(chloramphenicol,CHL;32g/mL)、阿米卡星(amikacin,AMK;64g/mL)、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(trimethoprim/sulfamethoxazole,T/S;4/76g/mL)和头孢曲松(ceftriaxone,CRO;64g/mL)。1.4 数据统计及图表绘制采用Excel2016软件进行数据统计分析和绘图。2 结果与分析2.1 金黄色葡萄球菌检出经nuc鉴定,27 株疑似金黄色葡萄球菌均为金黄色葡萄球菌,在各种生食蔬菜中的流行情况不同。其中,10 株(37.0%,10/27)菌mecA阳性
21、,全部对OXA敏感,均为OS-MRSA菌株(表1)。17 株(63.0%,17/27)菌为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillinsusceptibleStaphylococcus aureus,MSSA)。表 1 MSSA和OS-MRSA在生食蔬菜中的流行状况Table 1 Prevalence of MSSA and OS-MRSA in vegetables consumed raw蔬菜阳性率/%(菌株数/株)MSSAOS-MRSA生菜(n=5)40.0(2)60.0(3)菠菜(n=12)66.7(8)33.3(4)包菜(n=10)70.0(7)30.0(3)总计(n=27)6
22、3.0(17)37.0(10)注:西红柿中未检出金黄色葡萄球菌。下同。2.2 毒素编码基因检出在19 种供试毒素编码基因中共检出sea、seb、sec、seh、sek、sem、sen、seq 8 种。其中,sec检出率最高(29.6%,8/27),其次分别为seb和sek(22.2%,6/27),seh(11.1%,3/27),sea、sen和seq(7.4%,2/27),sem(3.7%,1/27)。未检出sed、see、seg、sei、sej、seo、sep、ser、set和seu等肠毒素编码基因和杀白细胞毒素基因pvl(表2)。表 2 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌毒素编码基因检出率Table
23、 2 Detection rates of toxin-encoding genes in S.aureus isolate from vegetables consumed raw毒素编码基因毒素编码基因检出率/%(菌株数/株)总计(n=27)生菜(n=5)菠菜(n=12)包菜(n=10)sea/8.3(1)10.0(1)7.4(2)seb20.0(1)25.0(3)20.0(2)22.2(6)sec/25.0(3)50.0(5)29.6(8)seh/8.3(1)20.0(2)11.1(3)sek20.0(1)25.0(3)20.0(2)22.2(6)sem/10.0(1)3.7(1)sen
24、/8.3(1)10.0(1)7.4(2)seq20.0(1)8.3(1)/7.4(2)注:/.未检出。下同。51.9%(14/27)的分离株至少携带1 种毒素编码基因,共检出9 种毒素编码基因谱。其中,seb-sec-sek(11.1%,3/27),sec、sec-seh和seb-sek-seq(7.4%,2/27),sea、sen、sea-seh、seb-sek和sec-sem-sen(3.7%,1/27)比较常见(表3)。表 3 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌毒素编码基因谱Table 3 Profiles of toxin-encoding genes in S.aureus isolates
25、from vegetables consumed raw毒素编码基因谱基因个数毒素编码基因谱检出率/%(菌株数/株)总计(n=27)生菜(n=5)菠菜(n=12)包菜(n=10)sea1/8.3(1)/3.7(1)sec1/20.0(2)7.4(2)sen1/8.3(1)/3.7(1)sea-seh2/10.0(1)3.7(1)seb-sek2/10.0(1)3.7(1)sec-seh2/8.3(1)10.0(1)7.4(2)seb-sec-sek3/16.7(2)10.0(1)11.1(3)seb-sek-seq320.0(1)8.3(1)/7.4(2)sec-sem-sen3/10.0(1
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