肾炎防衰液通过FGF21_SIRT1信号通路防治糖尿病肾病的机制研究.pdf
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1、肾炎防衰液通过/信号通路防治糖尿病肾病的机制研究孙 娜陈振杰吕 杰和 莹梁瑛楠王 健周静威(北京中医药大学东直门医院北京)摘要 目目的的 观察肾炎防衰液对糖尿病肾病()小鼠的干预作用并基于成纤维细胞生长因子()/沉默信息调节蛋白()信号通路探讨其防治 的潜在分子机制 方方法法将 只雄性/小鼠随机分为正常组、模型组、肾炎防衰液组及厄贝沙坦组每组 只 除正常组外其余组小鼠采用高脂饲料喂养联合小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素()方法构建 模型 造模成功后肾炎防衰液组给予肾炎防衰液./()灌胃厄贝沙坦组给予厄贝沙坦./()灌胃正常组和模型组给予等量的生理盐水灌胃均每日 次连续 周灌胃期间观察各组小鼠的体重
2、和血糖水平灌胃结束后检测各组小鼠肾功能指标尿白蛋白肌酐比()、血尿素氮()、血肌酐()、肾重/体重比、脂代谢指标血清总胆固醇()、三酰甘油()、低密度脂蛋白胆固醇()水平、血清 水平、染色观察肾脏病理形态免疫组化染色观察肾脏组织中 蛋白表达情况免疫荧光染色观察肾脏组织中、蛋白表达情况 结结果果 灌胃前各造模组小鼠体重、血糖明显高于正常组(均.)灌胃结束后模型组小鼠、肾重/体重比及血清、水平均明显高于正常组(均.)、染色见肾小球体积增大肾小管上皮细胞广泛空泡变性坏死肾小球硬化、纤维化改变明显肾脏组织中、蛋白表达少于模型组(均.)蛋白表达多于模型组(.)与模型组比较肾炎防衰液组及厄贝沙坦组小鼠 和
3、肾炎防衰液组血清、水平均明显降低(均.)、染色见小鼠肾脏病理损伤改善肾脏组织中、蛋白表达增多而 蛋白表达减少(均.)结结论论 肾炎防衰液可明显减轻 小鼠肾组织损伤保护肾脏机制可能与调控/通路、增强自噬有关关键词 糖尿病肾病肾炎防衰液自噬成纤维细胞生长因子 沉默信息调节蛋白:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 孙娜女在读博士研究生研究方向为中医药防治肾病内分泌疾病通信作者 周静威 :.基金项目 国家自然科学基金项目()/():()()/()./.()./()现代中西医结合杂志 ()./().()()()/()()().(.)./(.)(.)(.).(.)(.)./.:糖尿病肾病
4、()是糖尿病最常见且严重的并发症之一是世界上终末期肾病最常见的原因(占终末期肾病的 )我国 发病率超过了慢性肾小球肾炎相关慢性肾脏病成为慢性肾脏病的首位病因 发病率高、治疗难度大、社会经济负担重如何有效防治 具有重大意义 然而目前 治疗方案尚存在诸多不足亟须结合中医理论探索更为安全、有效的延缓 进展的治疗方法和药物 国医大师吕仁和教授提出“肾络微型癥瘕”的理论王耀献教授将祖国传统医学中的络病理论及癥瘕理论和现代医学对肾脏生理、病理的认识相结合进一步推进“肾络微型癥瘕”理论提出“肾络癥瘕”理论并将“聚散”概念引入肾络癥瘕理论中在“肾络癥瘕”理论的基础上将其细化为功能态、聚散消长态、癥瘕形成态三个
5、阶段以消癥散结为法拟定肾炎防衰液前期研究证实该方可以通过减轻氧化应激反应而发挥肾脏保护作用 本研究通过建立 小鼠模型进一步探讨肾炎防衰液对 的干预作用及延缓 进展的潜在机制以期为肾炎防衰液防治 提供客观依据 实验材料与方法 实验动物 周龄无特定病原体()级雄性/小鼠 只体重()购自北京华阜康实验动物技术有限公司生产许可证号:(京)所有小鼠饲养于北京中医药大学东直门医院 级实验动物屏障环境自由摄食、进水饲养环境保持恒温()、恒湿()/明暗交替室内通风良好本实验已取得北京中医药大学东直门医院动物管理委员会批准(伦理编号:)所涉及的研究方案符合中国伦理委员会关于实验动物的指导原则 药物与饲料 肾炎防
6、衰液(生黄芪 、当归、鳖甲、三七、海藻、生牡蛎、熟大黄 )由北京中医药大学东直门医院药学部提供用原药材总量的 倍体积的蒸馏水浸泡 后煎煮最后过滤浓缩至生药含量 /使用时按照比例稀释 厄贝沙坦赛诺菲(杭州)制药有限公司国药准字 规格:/粒由北京中医药大学东直门医院药学部提供将片剂研磨成粉溶于蒸馏水中配制成浓度为./混悬液低温封存备用 高脂饲料(脂肪 碳现代中西医结合杂志 ()水化合物 蛋白质总能量为./美国 公司货号:)普通饲料(脂肪 碳水化合物 蛋白质 总能量为./美国 公司货号:)主要试剂与仪器小鼠成纤维细胞生长因子()试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司货号:)小鼠血清肌酐()、尿素氮
7、()、总胆固醇()、三酰甘油()、低密度脂蛋白胆固醇()测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司货号分别为 、)小鼠尿微量白蛋白()试剂盒(上海酶联生物科技有限公司货号:)小鼠尿肌酐()测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司货号:)链脲佐菌素(货号:)./柠檬酸钠缓 冲 液(北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 货 号:)糖原 染色液(货号:)改良 三色染色液(货号:)沉默信息调节蛋白 ()抗体(货号:)微管相关蛋白 轻链()(货号:)/(货号:)兔二步法免疫组化检测试剂盒(中杉金桥货号:)显色试剂盒(中杉金桥货号:)(货号:)防荧光淬灭封片剂(含 货号:)荧光二抗(货号:)石蜡包
8、埋机、石蜡切片机、冰冻切片机、光学显微镜(德国 公司)离心机、全自动酶标仪(美国 公司)生物显微镜(蔡司 .)实验方法 只小鼠适应性饲养 周后随机分为正常组、模型组、肾炎防衰液组及厄贝沙坦组每组 只 正常组给予普通饲料喂养其余组小鼠参考文献方法采用高脂饲料喂养喂养 周后禁食 以上然后连续 腹腔注射 /(临用前溶解于./、.的./柠檬酸盐缓冲液现用现配低温避光 内使用)正常组小鼠腹腔注射等体积上述缓冲液 后连续 尾尖采血测随机血糖高于./视为糖尿病造模成功 定期监测血糖并留取尿液测定尿白蛋白肌酐比()造模成功后按照人与动物的体表面积等效剂量换算法小鼠给药剂量约为人临床用量的.倍肾炎防衰液组给予肾
9、炎防衰液./()灌胃厄贝沙坦组给予厄贝沙坦./()灌胃正常组和模型组给予等量的生理盐水灌胃均每日 次连续 周 干预期间模型组、肾炎防衰液组、厄贝沙坦组继续高脂饲料喂养正常组继续普通饲料喂养 样本采集灌胃 周后提尾反射法收集小鼠随机尿液样本以 /离心 收集上清夜分装 冰箱冻存备用小鼠过夜禁食 以上眼眶取血 /离心 收集上层血清分装 冰箱冻存备用 完整剪下右侧肾脏剥离包膜称重 分离肾皮质部分迅速放入冻存管投入液氮中转移至 冰箱保存剩余部分移至 多聚甲醛在 冰箱中固定 以上拟石蜡包埋的组织全自动脱水机脱水后进行石蜡包埋拟用于 包埋的组织经 蔗糖、蔗糖梯度脱水每个梯度浸泡 检测指标及方法 小鼠一般状态
10、、体重及血糖 实验过程中观察各组小鼠精神状态、活动情况、毛色、饮水饮食情况、尿量等灌胃过程中每 周测量 次小鼠体重及血糖 肾功能及肾重/体重比 严格按说明书检测血、和尿、尿 水平根据尿、尿 水平计算 根据各组小鼠肾重及体重计算肾重/体重比 血清脂代谢指标及 水平 严格按说明书检测血清、水平 肾脏组织病理形态 染色:烤片 二甲苯、和中分别脱蜡 梯度乙醇水化各 洗 次/次苏木素核染 自来水冲洗多余染液 盐酸乙醇分化 自来水冲洗返蓝 伊红染液染色 自来水冲洗 梯度乙醇上行脱水各 二甲苯、中分别透明 中性树胶封片光镜下观察 染色:石蜡切片常规脱蜡、水化同 染色操作滴加 过碘酸溶液反应 流水冲洗 蒸馏水
11、浸洗 次每次 染液阴暗处浸染 流水冲洗 苏木素染核及梯度乙醇上行脱水、透明、封片同 染色操作 染色:石蜡切片常现代中西医结合杂志 ()规脱蜡、水化同 染色操作 煤染液浸染 流水冲洗 天青石蓝染液滴染 水洗 次每次 苏木素染核 自来水冲洗多余染液盐酸乙醇分化至组织完全变红水洗终止分化流水冲洗 丽春红染液滴染 弱酸溶液冲洗 次每次 磷钼酸溶液处理 镜下观察血管周围胶原亮红色褪至淡红色或无色为止苯胺蓝染液滴染 弱酸溶液洗涤并覆盖静置 梯度乙醇上行脱水、透明、封片同 染色操作 肾脏组织中 蛋白阳性表达情况石蜡切片常规脱蜡、水化 浸洗 次每次 水浴锅预热柠檬酸盐修复液(.)至 以上切片浸入修复液修复 自
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