湿地松木质部和针叶松脂合成基因分析.pdf
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1、热带亚热带植物学报 2023,31(4):531 540 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2022-06-17 接受日期接受日期:2022-07-25 基金项目基金项目:国家自然科学基金项目(32160389);江西林业科学院青年科技人才培养项目(2021522901)资助 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant No.32160389),and the Project for Distinguish
2、ed Young Scholars of Jiangxi Academy of Forestry(Grant No.2021522901).作者简介:张文娟(1996 年生),女,硕士,主要从事林木遗传育种研究。E-mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail: 湿地松木质部和针叶松脂合成基因分析湿地松木质部和针叶松脂合成基因分析 张文娟1,谷振军2,胡珊2,张志红3,李火根1,杨春霞2*(1.南京林业大学,林木遗传与生物技术教育部重点实验室,南方现代林业创新中心,南京 210037;2.江西省林业科学院林木遗传育种与栽培研究所,南昌 330032;3.峡江县林
3、木良种场,江西 吉安 331409)摘要:摘要:为挖掘湿地松(Pinus elliottii)松脂合成相关的基因,对不同采脂期的木质部和针叶进行高通量转录组测序,与火炬松(Pinus taeda)参考基因组进行比对,共获得了 68 211 条 unigenes,546 356 450 条 clean reads,平均比对率达 90.21%。将不同时期木质部、木质部与针叶间进行两两对比,以 P1.0 为标准来筛选差异基因,并进行 GO 和 KEGG富集分析。结果表明,参与萜类物质合成的差异基因有 133 个,其中大部分富集在 MEP 途径,从差异基因中挑选 8 个产脂相关的候选基因进行 RT-q
4、PCR 验证,确定 HMGR、DXS、TPS、ABC 转运蛋白基因与产脂存在关联性。通过转录组测序与分析,挖掘出 133 个参与松脂萜类物质合成相关的差异基因,其中萜烯合酶基因(TPS)和 ABC 转运基因在正调控萜类物质合成中发挥关键作用。关键词:关键词:湿地松;松脂;转录组;产脂候选基因 doi:10.11926/jtsb.4691 Genes Related to Resin Biosynthesis in Xylem and Needle of Pinus elliottii ZHANG Wenjuan1,GU Zhengjun2,HU Shan2,ZHANG Zhihong3,LI
5、Huogeng1,YANG Chunxia2*(1.Key Laboratory of Forest Genetics&Biotechnology of Ministry of Education,Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China;2.Institute of Forest Genetic Breeding and Cultivation,Jiangxi Academy of Forestry,Nanch
6、ang 330032,China;3.Xiajiang County Forest Seed Farm,Jian 331409,Jiangxi,China)Abstract:In order to explore the genes related to pine resin biosynthesis in Pinus elliottii,a total of 12 samples of xylem at different resin collection stages and needles were used for high-throughput transcriptome seque
7、ncing.Compared with the reference genome of P.taeda,a total of 68 211 unigenes and 546 356 450 clean reads were obtained with an average mapping rate of 90.21%.The expression profiles between needles and xylem were compared in pairs.The differentially expressed genes(DEGs)were selected according to
8、P 1.0,and then annotated by GO and KEGG enrichment analysis.The results showed that 133 DEGs involved in terpene synthesis,most of which were enriched in MEP pathway.Eight candidate genes related to pine resin biosynthesis were selected from the DEGs and validated by RT-qPCR,in which HMGR,DXS,TPS,AB
9、C transporter genes were highly correlated with the rosin production.Therefore,133 differential genes related to pine resin biosynthesis were mined through transcriptome sequencing,and among which three TPS genes and two ABC transporter genes positively regulate terpenoid synthesis.Key words:Pinus e
10、lliottii;Resin;Transcriptome;Candidate genes involved in resin biosynthesis 532 热带亚热带植物学报 第 31 卷 湿地松(Pinus elliottii)属于常绿乔木,自上世纪三十年代从美国引进国内1,因其生长迅速、产脂力高、抗性强等特点,很快成为我国南方地区重要的造林树种2。近年来,湿地松因其松脂产量高、杂质少、松节油含量高等优势,脂用价值日益凸显,加上松材线虫病危害致使马尾松(P.massoniana)栽培面积不断缩减,在某些地区湿地松已逐渐取代马尾松成为主要采脂树种34。松脂不仅能为生产林化产品提供可再生的原
11、料,也是松树抵御昆虫以及食草动物攻击的重要手段5。松脂是萜烯类混合物,以异戊二烯亚基(C5)为基本单位,主要通过 2 种不同的途径:甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)和甲基赤藓糖磷酸(methyl-erythritol phosphate,MEP)途径合成。目前在马尾松中利用转录组测序6、在油松(P.tabuliformis)中利用基因组测序7初步解析了松脂生物合成调控机制,并发现了一些可能参与调控松脂合成的关键基因,如萜烯合酶、细胞色素 P450、ABC 转运蛋白和香叶基二磷酸合酶等。然而,相对于其他产脂树种,湿地松松脂合成相关的调控机制方面研究较少。江西省湿地松的采脂期通常为
12、 5 月10 月,松脂产量在 7、8 月达到峰值,到 10 月底采脂活动基本结束。本研究选取湿地松第一代种子园中同一无性系-142 在不同采脂期 4、8、10 月的木质部和针叶作为样本进行转录组测序,与火炬松(P.taeda)基因组进行比对,以了解湿地松松脂合成相关基因随季节性变化的表达差异,并通过对比产脂高峰期(8 月)与产脂量低谷时期(4、10 月)、高产脂无性系与低产脂无性系的基因表达差异,筛选出松脂合成的关键调控基因,以期为后续的高产脂育种工作提供科学的参考。1 材料和方法 1.1 材料材料 选择江西省峡江县林木良种场湿地松第一代种子园(11524 E,2733 N)中无性系-142
13、为试验材料,分别在 4 月(采脂前期)、8 月(采脂高峰期)和10 月(采脂结束期)采集无性系 1.3 m 胸径处树干的木质部组织和针叶,4、8、10 月的木质部样本编号为 SAPB、SAUB、SOCB,针叶为混样,编号为 SPN,每组样本设置 3 个重复。采集同一种子园中的高产脂无性系 2-0420(产量约 20 kg/ind.)和低产脂无性系 2-113(产量约 5 kg/ind.)的木质部和针叶进行 RT-qPCR(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction)验证,所有样品采集后放入液氮速冻,保存在-80 超低温冰箱
14、中随时取用。1.2 RNA 提取和转录组测序提取和转录组测序 CTAB 法提取总 RNA,采用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop 及 Agilent 2100 分析仪检测总 RNA 的浓度、纯度以及完整性。构建 cDNA 文库,首先利用Oligo(dT)磁珠对 mRNA 进行富集,然后用阳离子随机打断 mRNA,并以得到的片段为模板获得 cDNA文库。文库构建后使用 Agilent 2100 bioanalyzer 和RT-qPCR 对文库质量进行检测,检测合格后采用IlluminaHiSep4000 进行转录组测序。1.3 数据质控、基因比对及组装数据质控、基因比对及组装 转录组测序获得的原始
15、数据(raw reads)首先要进行过滤,除掉质量低的、带接头的以及碱基信息不明确的 reads,从而获得高质量的 clean reads。其次,对 clean data 进行 Q20、Q30 和 GC 含量的计算。最后使用 HISAT2 软件将质控后的 clean reads 与火炬松基因组进行比对,并用 StringTie 软件进行新转录本组装。1.4 差异基因筛选及富集分析差异基因筛选及富集分析 差异基因表达分析通过 DESeq2 软件(1.20.0)进行,并使用 Hochberg 和 Benjamini 的方法来对 P 值进行调整,以 P1.0 为标准筛选差异基因,通过 cluster
16、Profiler(3.4.4)软件对差异基因进行 GO 和 KEGG 富集分析,并修正了基因长度偏差。1.5 产脂相关基因表达验证产脂相关基因表达验证 挑选 8 个与产脂相关的基因进行实时荧光定量PCR,验证其在无性系-142 的 4、6、8、10 月的木质部和针叶中的表达量以及在高、低产脂的无性系中的表达量差异。利用 PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa,大连)进行反转录,并通过 Primer-BLAST 在线平台设计引物(表 1),内参基因为 UBI。用 CFX 实时定量 PCR 扩增仪(Bio-Rad,上海)进行实时
17、荧光定量 PCR,反应程序为 95 30 s,95 5 s,60 30 s,共 40 次循环。使用 2CT法计算相对表达量。2 结果和分析 2.1 转录组数据质量评估及组装转录组数据质量评估及组装 对原始数据进行过滤得到 546 356 450 条 clean第 4 期 张文娟等:湿地松木质部和针叶松脂合成基因分析 533 表 1 荧光定量 PCR 引物 Table 1 Primers of quantitative real-time PCR 基因 Gene 功能 Function 正向引物 Forward primer(53)反向引物 Reverse primer(53)PITA_1311
18、2 羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 HMGR TGCGAGGGAAGACGAGAAAC CCAACGAAATCCCGTTCAGC PITA_15631 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 DXS GACAAATGGCCTCTCAGGCT CCCCTTTCAAGTCACGACCA PITA_39473 萜烯合酶 TPS TCACAGCGGCAGTTAAGAGG TGCTTCTCCTGCCATTTCGT PITA_38904 萜烯合酶 TPS AGACACGCTCAACTATGCCC ATGTGCCAATGCGATAACCG PITA_28724 萜烯合酶 TPS TTTCGGGCTTCCCAAAT
19、TGC TCTCGTGAAAGACCGCAGAC PITA_33107 ABC 转运蛋白 ABC transporter CACGATGTGAGTGGTGGGAA ACTTGAGATTTGGGAGCCCG PITA_13961 ABC 转运蛋白 ABC transporter TCTTCTGGACGAGGCCACTA AGAGGCGATGAGCAACAACA PITA_05351 ABC 转运蛋白 ABC transporter GGAAAGGAAGGAGCCAGCAT CTTTTGCCCTCCCGACATCT reads,总碱基为 81.94G。每个样本的 Q20 值均超过98%,Q30 值
20、平均为 94.77%,GC 含量为 4446.5,且与火炬松基因组的平均比对率达到 90.21%(表2)。不同样本间的相关性系数为 0.8290.961,说明样本间的表达模式比较接近。这表明转录组数据质量较好,可以用于后续分析。并利用 StringTie 软件共获得了 16 460 条新的 unigenes,加上比对上火炬松转录组的 51 751 条 unigenes,共获得 68 211 条 unigenes。表 2 样品测序的质量评估 Table 2 Quality assessment of sample sequencing 样品 Sample 有效读数 Clean reads 有效碱
21、基 Clean base(G)错误率 Error rate/%Q20/%Q30/%GC 含量 GC content/%比对率 Mapping rate/%SAPB1 44 486 976 6.67 0.02 98.28 94.77 45.27 89.51 SAPB2 46 965 990 7.04 0.02 98.22 94.56 45.02 89.41 SAPB3 45 608 798 6.84 0.02 98.24 94.61 44.87 89.39 SAUB1 43 784 800 6.57 0.02 98.25 94.60 44.95 90.18 SAUB2 44 650 364 6.
22、70 0.02 98.34 94.81 44.92 89.27 SAUB3 45 091 286 6.76 0.02 98.30 94.74 45.13 89.01 SOCB1 45 677 568 6.85 0.02 98.44 95.03 44.93 90.79 SOCB2 48 009 558 7.20 0.02 98.28 94.62 44.79 90.07 SOCB3 44 206 068 6.63 0.02 98.41 94.89 44.84 91.07 SPN1 46 744 072 7.01 0.02 98.32 94.67 46.35 91.24 SPN2 45 394 47
23、0 6.81 0.02 98.42 94.92 46.23 91.72 SPN3 45 736 500 6.86 0.02 98.47 95.01 45.60 90.86 合计 Total 546 356 450 81.94 平均 Average 98.33 94.77 45.24 90.21 2.2 差异基因表达分析差异基因表达分析 以 P1.0 为基因差异表达的筛选标准,从图 1 可见,不同采脂时期木质部中差异表达基因数量不一,其中以 8 月与 10 月样品间(SAUB vs SOCB)的差异基因最多,为 6 023 个unigenes,8 月与 4 月间(SAUB vs SAPB)的差异
24、基因最少,为 3 221 个 unigenes,3 个对比组合(图 2)共有的差异基因仅为 366 个 unigenes,少于它们各自独有的差异基因。相对于不同采脂时期,不同组织间获得的差异基因数量较多(图 1),其中以 8 月份木质部与针叶间(SAUB vs SPN)的差异基因最多,为12 908个unigenes,包括 5 287 个上调基因和 7 621 个下调基因,3 个不同比对组合(SAPB vs SPN、SAUB vs SPN、SOCB vs SPN)中,共有的差异基因为 6 919 个,4、8、10 月各自独有的差异基因分别为 1 800、2 333 和 2 255 个(图 2)
25、。2.3 差异基因的差异基因的 GO 富集分析富集分析 对所有样本间的差异基因进行 GO 富集分析(图 3),结果表明木质部与针叶间(SAPB vs SPN、SAUB vs SPN、SOCB vs SPN)差异最显著的条目均为光合作用,而 SOCB vs SPN 组合用于蛋白质翻译的 tRNA 氨基酰化(tRNA aminoacylation for protein translation)、tRNA 氨基酰化(tRNA aminoacylation)534 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 1 不同采脂时期湿地松不同器官的差异基因数。SAPB:4 月木质部;SAUB:8 月木质部;SOC
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