米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(42106203)第一作者:杨桂琴(1995),女,硕士研究生,研究方向为水产动物病害及免疫学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:LDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220806001杨桂琴,李晓东,路玮静,等.米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析J.生态毒理学报,2023,18(3):312-325Yang G
2、Q,Li X D,Lu W J,et al.Transcriptome analysis about effect ofKarenia mikimotoionOryzias melastigmaJ.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):312-325(in Chinese)米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析杨桂琴1,李晓东1,*,路玮静1,李健鑫1,李靖2,常阳1,王紫阳1,张伟妮1,3,陈新华11.福建农林大学海洋学院,福建省海洋生物技术重点实验室,福州 3500022.闽江学院,福州海洋研究院,福建省海洋生物多样性保护与永续利用重点实验
3、室,福州 3501083.福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室,福州 350002收稿日期:2022-08-06 录用日期:2022-10-07摘要:近年来我国近岸米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻华频发,给当地水产养殖业带来严重的损失,但该藻在海洋生物分子?水平上的影响尚不明确。本实验通过转录组学分析,探究了米氏凯伦藻对模式生物海水青鳉(Oryzias melastigma)鳃和肝脏?mRNA 转录水平的影响。结果发现受藻作用 96 h 后,青鳉鳃与肝脏中分别有 508 个与 604 个差异表达基因(differentially ex-pressed gen
4、es,DEGs),其中上调基因分别有184 个和390 个,下调基因分别有324 个和214 个。Gene ontology(GO)功能分类结果显示 DEGs 多集中于生物进程和分子功能,进一步 GO 富集分析结果表明,米氏凯伦藻能够显著影响青鳉鳃组织中凝血酶激活受体活性、受体信号通路和离子跨膜运输等相关通路;肝脏中氧运输和结合进程相关通路也受到显著影响。Kyoto ency-clopedia of genes and genomes(KEGG)功能富集分析表明鳃和肝脏组织中 DEGs 均显著富集于免疫系统的补体和凝血级联反应,鳃 DEGs 还富集在 IL-17 免疫信号分子和细胞因子相互作用
5、信号转导通路;而肝脏 DEGs 还富集在脂质、氨基酸代谢通路。此外,免疫因子serpine1、hsp90b1、bcl2l1在鳃中均被显著抑制,而凝血因子f2、f5、plg在肝脏中均被显著上调。实验结果表明?米氏凯伦藻可能对海水青鳉鳃造成了一定程度的氧化损伤,也可能通过激活 IL-17 信号通路导致免疫炎症的发生。同时该藻还导致海水青鳉肝脏纤溶系统被激活,代谢功能发生变化。关键词:米氏凯伦藻;海水青鳉;影响效应;转录组分析;免疫文章编号:1673-5897(2023)3-312-14 中图分类号:X171.5 文献标识码:ATranscriptome Analysis about Effect
6、of Karenia mikimotoi on Oryzias melastigmaYang Guiqin1,Li Xiaodong1,*,Lu Weijing1,Li Jianxin1,Li Jing2,Chang Yang1,Wang Ziyang1,Zhang Weini1,3,Chen Xinhua11.Marine Research Institute,Fujian Agriculture and Forestry University,Fujian Key Laboratory of Marine Biotechnology,Fuzhou350002,China2.Fujian K
7、ey Laboratory on Conservation and Sustainable Utilization of Marine Biodiversity,Fuzhou Institute of Oceanography,Min-jiang University,Fuzhou 350108,China3.University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcare in FujianProvince,Fujian Agri
8、culture and Forestry University,Fuzhou 350002,ChinaReceived 6 August 2022 accepted 7 October 2022第 3 期杨桂琴等:米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析313 Abstract:In recent years,harmful algal blooms caused byKarenia mikimotoihave occurred frequently in coastalwaters of China,and caused huge financial losses to local aqu
9、aculture industry.However,its effect on marine or-ganisms at molecular level is still unclear.In this work,transcriptome analysis was used to explore the effects ofK.mikimotoion mRNA transcription in gill and liver of model organism marine medaka(Oryzias melastigma).Re-?sults showed that 508 and 604
10、 differentially expressed genes(DEGs)were detected in gill and liver after 96 h treat-ment,in which 184 and 390 DEGs were up-regulated,while 324 and 214 DEGs were down-regulated,respectively.Gene ontology(GO)functional classification showed that DEGs in both gill and liver were mainly concentrated i
11、nbiological process and molecular function.Further GO enrichment analysis showed thatK.mikimotoicould signifi-?cantly affect the activities of thrombin-activated receptors,receptor signal pathway and ion transmembrane transportin gill ofO.melastigma,as well as oxygen transport and binding pathways i
12、n liver.Kyoto encyclopedia of genes?and genomes(KEGG)functional enrichment analysis showed that DEGs were significantly enriched in complementand coagulation cascade of immune system in both gill and liver,DEGs in gill were also enriched in IL-17 immunesignal molecule and cytokine interaction signal
13、 transduction pathway,while DEGs were also enriched in lipid andamino acid metabolic pathway in liver.In addition,immune factors likeserpine1,hsp90b1andbcl2l1were signifi-?cantly inhibited byK.mikimotoiin gill ofO.melastigma,while coagulation factors,such asf2,f5andplg,were?significantly up-regulate
14、d in liver.Results indicated thatK.mikimotoimight cause a certain degree of oxidative?damage to the gill ofO.melastigma,which might be related to immune inflammation caused by activating IL-17?signal pathway.Results also indicated thatK.mikimotoicould activate fibrinolytic system in liver and change
15、 its?metabolic function.Keywords:Karenia mikimotoi;Oryzias melastigma;influence effect;transcriptome analysis;immune 有害藻华(harmful algal blooms,HABs)是指因微藻等生物大量繁殖,导致水产品死亡,破坏生态系统功能,威胁人类健康和生命安全的一种环境异常生态现象1-4,其频发与人类活动导致的海水富营养化、全球气候变化等问题相关5-7。米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻华是一种对海水养殖业危害?严重的有害藻华,广泛分布于亚洲、欧洲、美洲与非洲的
16、近岸海域2。该藻藻华同样是我国近岸主要有害藻华之一8,自 1998 年在香港近岸暴发导致大量养殖鱼类死亡以来9,常年在我国渤海、东海等多地暴发,经济损失以数十亿元计10,其中仅 2012 年福建近岸因其导致的鲍鱼养殖业的损失就高达 20.1亿元11。高密度的米氏凯伦藻不仅能够导致养殖鱼类与贝类大量死亡,对其他海洋生物也有显著的不利影响12,如降低甲壳类的运动能力13、抑制中华哲水蚤摄食14、导致海胆、海星15等多种生物死亡。该藻能破坏鱼类与贝类的鳃,使其出现明显的鳃上皮细胞水肿、充血、脱落和皱缩等组织病变现象16-17,从而影响其呼吸和渗透压调节。米氏凯伦藻还能显著降低贝类淋巴细胞的黏着性与吞
17、噬能力18,抑制细胞增殖,使鱼类胚胎滞长、畸变19,影响斑马鱼胆碱能和神经系统的正常发育20,表现出明显的免疫毒性和细胞毒性。米氏凯伦藻对多种生物的抗氧化、生殖与内分泌系统也有显著的不利影响18,20-22。但该藻对海洋生物分子水平的影响效应及相应机制的探究存在缺失。转录组测序(RNA-Seq)能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的所能转录出来的所有 RNA 的总和,以其高通量测序能力、高灵敏度、宽范围、用时短、高效率、高重复性和低成本特点而被广泛应用23-24。该技术同样被广泛应用于有害藻毒性效应与机制的研究中,如微囊藻毒素-LR(MC-LR)能通过 TLR/MyD88 介导
18、的信号通路引发斑马鱼慢性炎症反应25,并且通过补体和凝血级联途径导致草鱼免疫功能受损26。而海水青鳉(Oryzi-as melastigma)因其个体小、性别易区分、繁殖周期?短、产卵率高,可在实验室条件下大规模饲养等优点,已成为我国海洋生态毒理学研究的模式生物27-29。Qiao 等30通过海水青鳉的综合组学分析,发现 MC-LR 能够影响能量产生、蛋白质生物合成和脂质代谢途径,导致生殖障碍。故本文选取海水青鳉为研究对象,借助 RNA-Seq 和生物信息学分析方法,探究米氏凯伦藻对海水青鳉分子转录水平的影响。314 生态毒理学报第 18 卷1 材料与方法(Materials and meth
19、ods)1.1 实验生物培养米氏凯伦藻和对照用小球藻(Chlorellasp.)均由?中国科学院海洋研究所藻种中心提供,福建农林大学海洋研究院重点实验室连续培养,所有藻类均使用 f/2 海水培养基31纯种培养,培养/实验环境为温度(191),光照强度(2 650100)lx,光暗比 14 h 10 h。海水青鳉由闽江学院提供,循环水系统连续培养至 5 月龄成鱼,养殖期间水温 22 28,光暗比12 h 12 h。仔鱼到成鱼各阶段每天 9:00 和 17:00分别投喂轮虫、卤虫和优质饲料 2 次,每周更换新鲜的循环海水。用于藻类培养和实验鱼养殖的海水购自福建省海水公司,藻类培养和实验用海水均经
20、0.45 m 混合纤维滤膜过滤后高温高压消毒后备用。1.2 实验处理及样品采集指数生长期的米氏凯伦藻在光学显微镜下记录藻密度,用无菌海水稀释至终密度 2104cells 齺mL-1到 500 mL 玻璃烧杯中(实验体积 400 mL),对照组添加与实验组等生物量的小球藻,空白组添加与实验组等量的无菌海水32。大小均一,状态健康的海水青鳉成鱼提前移至实验环境适应 24 h 后随机挑到各组中,每组 3 个平行,每平行 10 条鱼。通过调节曝气保持各组溶解氧水平相当。实验进行 96 h,每 24 h 喂食并更换新鲜藻液与无菌海水。取样前24 h 停止喂食,0.02%MS-222 溶液将海水青鳉麻醉后
21、迅速完整分离鳃(GI)和肝脏(LI)组织于无酶冻存管中,液氮速冻后80保存。1.3 转录组测序与分析Trizol(Invitrogen,美国)法提取组织 Total RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量,NanoDrop 2000检测 RNA 浓度和纯度,RNA 6000 Nano Kit 检测RNA 完整性。反转录构建 cDNA 文库后用 IlluminaHiSeq 2000 进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。测序原始样本(raw reads)使用软件 Fastp 质控后得到高质量的质控数据(clean reads)。使用软件 TopHat2 进行序列比对(来源:https:
22、/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid30732orgn;参考基因来源:Oryzias_melastigma;参考基因组版本:GCF_?002922805.1)获得匹配数据(mapped reads),RSeQC-2.3.6 整体质量评估后使用拼接软件 String Tie 进行转录组组装。利用软件 RSEM 定量分析基因和转录本的表达量,DESeq2 分析鉴定样本间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)(差 异 条 件:log2fold changes1 且 false discovery rate(F
23、DR)0.05),并用 Benjamini and Hochberg(BH)方法对差异检验P-value 进行多重检验矫正后构建 DEGs 基?因集。利用 Gene ontology(GO)和 Kyoto encyclopediaof genes and genomes(KEGG)数据库进行功能分类。用 Fisher 精确检验方法,使用 Goatools 软件和KOBAS 软件分别进行 GO 和 KEGG 富集分析。并进行 BH 多重检验,当校正的P0.05、P0.01 视?为显著。1.4 实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)验证 从测序结果中
24、筛选出 12 个差异表达基因(ser-pine1、hsp90b1、bmp10、plat、sugt1、bcl2l1、ddit、nr4a1、dusp1、f2、f5、tbxas1、plg)进行 qPCR 验证(引?物序列见表 1)。通过测序提取的 Total RNA 使用反转录试剂盒(Promega,美国)合成 cDNA,经纯化、末端修复、连接接头后进行 PCR 扩增,得到 cDNA 文库,qPCR 反应程序为 95 预变性 150 s;9515 s,6020 s,7220s,40 个循环。以 18s 为内参基因,采用 2-Ct33方法分析结果,使用 SPSS 软件进行统?计学分析。2 结果(Res
25、ults)2.1 RNA-Seq 数据质量评估及序列比对分析本实验构建了暴露 96 h 后海水青鳉鳃和肝脏组织共 12 个样本的转录组文库,各样本的 cleanreads 均在4 389 万条以上,质控数据的测序碱基 Er-ror rate 均0.8;在样本间 PCA 分析时(图 1),同组织组内的样本都聚集于同一象限中,说明组内重复性较强,组间差异较大,可进行下一步分析。第 3 期杨桂琴等:米氏凯伦藻对海水青鳉影响效应的转录组学分析315 表 1 荧光定量 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR基因名称引物序列(5 3)登录号Gene namePr
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