锰基纳米材料用于胃肠道恶性肿瘤的化学动力治疗.pdf
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1、恶性肿瘤已成为大多数患者死亡的主要原因,其中结直肠癌和胃癌的死亡率居全世界第2和第3位 1-3,目前根治性手术切除仍是胃肠道恶性肿瘤患者治愈的唯一机会,据报道约50%的患者术后5年内复发,且中晚期胃肠道恶性肿瘤患者的复发率更高 4,5。多项研究证实,对于晚期肿瘤或肿瘤术后复发转移患者,一线、二线化疗为最佳支持治疗,可延长中位生存时间,提高生活质量 6-9。针对此类患者而言,2020年美国国立综合癌症网络、欧洲肿瘤协会以及中国卫生部均推荐铂类联合氟尿嘧啶类药物作为一线治疗药物。尽管其研究工作取得了重大的进展,但此类治疗药物选择仍然有限,且毒副作用严重 10,11。因此,寻找一种既能提高疗效又能避
2、免传统辅助化疗毒副作用的新治疗方案是突破目前锰基纳米材料用于胃肠道恶性肿瘤的化学动力治疗锰基纳米材料用于胃肠道恶性肿瘤的化学动力治疗林晓丰1,黄马养1,陈君千1,周 逊1,钟卓丹1,陆文聪2,黄显莹3,刘添文11广州中医药大学第二附属医院脾胃病科,广东 广州 510515;2广东省妇幼保健院儿科,广东 广州 510515;3南方医科大学南方医院血管介入科,广东 广州 510515Manganese-based nanoparticles for chemodynamic therapy of gastrointestinal cancerLIN Xiaofeng1,HUANG Mayang1,
3、CHEN Junqian1,ZHOU Xun1,ZHONG Zhuodan1,LU Wencong2,HUANG Xianying3,LIU Tianwen11Department of Spleen and Stomach Diseases,Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510515,China;2Department of Pediatrics,Guangdong Women and Childrens Hospital,Guangzhou 510515,Ch
4、ina;3Department of VascularInterventional Therapy,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China摘要:目的 探讨携载葡萄糖氧化酶的富含锰介孔硅纳米(MSNMn-GOx)的制备、物化表征及其治疗胃肠道恶性肿瘤的效果。方法 检测MSNMn-GOx的形貌、大小、元素、价态、电位、耗氧能力及类芬顿性能;采用核磁共振成像(MRI)方法分析MSNMn-GOx在T1加权下的成像能力,构建荷瘤小鼠肠癌模型(n=3),通过尾静脉注射MSNMn-GOx观察注射前后的T1成像能力
5、;体外试验分为Control组(PBS)、含锰介孔硅(MSNMn)组(20 g/mLMSNMn纳米颗粒)及携载葡萄糖氧化酶的富含锰介孔硅(MSNMn-GOx)组(20 g/mLMSNMn-GOx纳米颗粒),按上述分组对胃肠癌细胞进行处理。分别采用细胞增殖-毒性实验(CCK-8)、细胞免疫荧光实验检测MSNMn-GOx诱导胃肠癌细胞的活性氧(ROS)生成、细胞增殖及细胞杀伤能力的改变。结果 MSNMn-GOx为带负电荷的100 nm类圆形实心纳米颗粒,可催化葡萄糖产生大量氧气继而增加H2O2浓度。相比于中性H2O2溶液,MSNMn-GOx在低酸条件(pH=6.0)下可催化生成更多羟自由基(P0.
6、05)。MRI成像试验中,MSNMn-GOx有浓度依赖性的T1增强成像效果,在荷瘤小鼠体内观察到,相比于注射前,注射MSNMn-GOx后的瘤体有T1增强信号(P0.01)。细胞免疫荧光实验显示:相比于Control组,MSNMn及MSNMn-GOx均可明显诱导胃肠癌细胞ROS产生(P0.05)。CCK-8实验显示,相比于Control组,MSNMn及MSNMn-GOx对胃肠癌细胞浓度依赖性杀伤效果(P0.05)。Edu实验显示,相比于Control组,MSNMn及MSNMn-GOx均可抑制胃肠癌细胞的增殖能力(P0.05)。结论MSNMn-GOx具有良好的MRI成像效果、自产H2O2能力及类芬
7、顿性能,可诱导胃肠癌细胞内ROS产生进而产生良好的抗肿瘤效应,是胃肠道恶性肿瘤治疗的一种潜在新方法。关键词:锰基纳米材料;纳米颗粒;胃肠道肿瘤;化学动力治疗Abstract:Objective To investigate the physicochemical features of glucose oxidase-loaded and manganese-based mesoporoussilica nanoparticles(MSNMn-GOx)and its antitumor effect against gastrointestinal cancer.Methods The mor
8、phology,particle size and Fenton-like properties of MSNMn-GOx nanoparticles were analyzed using transmission electronmicroscopy(TEM),dynamic light scattering(DLS),Zeta potential analysis,ultraviolet absorption spectroscopy,energydispersive spectroscopy and X-ray photoelectron spectroscopy.A mouse mo
9、del bearing human colon cancer HT-29 xenograftwas established to examine the antitumor effect of MSNMn-GOx using MRI imaging.Reactive oxygen species(ROS)production assay,CCK-8 assay and EdU assay were used to evaluate the in vitro anti-tumor effect of the nanoparticles.ResultsMSNMn-GOx nanoparticles
10、 were solid spheres with a diameter of about 100 nm and a Zeta potential of-35 mV.MSNMn-GOx had a higher H2O2catalytic efficiency in glucose containing solution than in glucose-free solution,and showed a strongerFenton-like properties at pH6.0 than at pH7.4(P0.05).In the tumor-bearing mice,MSNMn-GOx
11、 treatment dose-dependentlyenhanced T1 imaging of the tumor(P0.01).Compared with the control group and MSNMn group,MSNMn-GOx induceda significantly higher level of ROS production and a stronger inhibitory effect on the proliferation of gastric and colon cancercells(P0.05).Conclusion MSNMn-GOx nanopa
12、rticles have good chemodynamic properties and a strong anti-tumor effectand provide a potential therapeutic option for gastric cancer.Keywords:manganese-based nanomaterials;nanoparticles;gastrointestinal cancer;chemodynamic therapy收稿日期:2023-03-22基金项目:广东省自然科学基金(2020B1515120045,2020A1515110151)作者简介:林晓
13、丰,住院医师,E-mail:通信作者:刘添文,副主任医师,E-mail:;黄显莹,主治医师,E-mail:doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.08.22J South Med Univ,2023,43(8):1432-14391432突破胃肠道恶性肿瘤治疗瓶颈的关键。化学动力治疗(CDT)是利用金属催化剂在肿瘤缺氧微环境下,将细胞内过表达H2O2转化为高毒性羟基自由基(OH),在不需要外界刺激的情况下引起肿瘤细胞严重的氧化损伤 12。与其他治疗方式相比,CDT由肿瘤微环境特异性触发,能够有效减少对体内正常组织的损伤 13。另外,CDT与化疗联合具有显著的协同作
14、用,一方面可以通过化疗药物增加H2O2浓度,使CDT治疗效果增强,另一方面可以减少化疗药物的副作用,因此,CDT与化疗相结合有望成为一种新型、有效的胃肠道恶性肿瘤治疗方案 14,15。而作为化学动力试剂的锰基金属纳米材料,如MnO、MnO2、MnSiO3、MnS等,适合在肿瘤组织的微酸性(pH 4.56.5)环境中催化类芬顿反应,从而重塑肿瘤微环境,诱导肿瘤细胞死亡,因而在肿瘤治疗中极具潜力。一般情况下,被动的锰基纳米药物疗效差、副作用大。因此,需要赋予纳米药物具备主动递送能力及催化属性来促进肿瘤细胞内摄取并提高类芬顿催化效率,进而强化CDT作用。基于此,本研究制备了一种新型的纳米材料,即携载
15、葡萄糖氧化酶的富含锰介孔二氧化硅(MSNMn-GOx),探索了其物化表征以及在胃肠癌细胞系中的抗肿瘤效应,以证实该材料是否能够用于胃肠道恶性肿瘤的CDT。1 材料和方法1.1 MSNMn-GOx的合成首先,将2 g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)与0.02 g三乙胺(TEA)混合,加入20 mLddH2O,在80 下搅拌 20 min 进行预热。加入 1.5 mL 正硅酸乙酯(TEOS)并在80 下搅拌4 h。离心后,分别用乙醇和ddH2O洗3次。然后将产物溶于20%盐酸,75 洗涤12 h,洗涤3次,除掉CTAC。其次,10 mL得到的纯净MSN溶液加入10 mL MnSO4H2O(8 mg
16、/mL),搅拌20 min,然后将混合物转移至高温反应器中(180 12 h),将所得产物ddH2O洗涤3次,得到MSNMn纳米。将GOx(1 mg/mL)添加到MSNMn纳米溶液中,室温避光搅拌4h,得到MSNMn-GOx纳米颗粒。1.2 MSNMn-GOx的形态大小将MSNMn-GOx纳米颗粒稀释并滴加到镍网上,使用 JEM-2100F透射电子显微镜(日本JEOL)拍摄MSNMn-GOx的表面形态。利用动态光散射原理测定MSNMn和MSNMn-GOx纳米颗粒的粒径和电势。用能源分析EDS分析纳米元素种类。用电感耦合等离子体质谱分析仪ICP分析纳米复合物中锰的含量。用光电子能谱仪XPS分析纳
17、米复合物中锰的价态。1.3 MSNMn-GOx的化学动力效能采亚甲基蓝(MB)评估MSNMn-GOx的化学动力效能,即类芬顿催化能力。MSNMn-GOx与不同pH的PBS(pH=6.0和pH=7.5)孵育后,采用分光光度计检测各组溶液在=664nm的吸光度。1.4 MSNMn-GOx的氧气消耗水平MSNMn-GOx与含/不含葡萄糖的含氧溶液中进行孵育,使用溶解氧仪(Thermo)检测不同时间点溶液中的氧含量。1.5 MSNMn-GOx的核磁成像(MRI)能力雌性裸鼠(45周龄)购自南方医科大学实验动物中心。将肠癌细胞(HT-29)以5106/200 L的密度注射到雌性裸鼠的右背部,构建荷瘤小鼠
18、肠癌模型。当荷瘤小鼠肿瘤体积超过20 mm20 mm20 mm时,在麻醉下将MSNMn-GOx纳米颗粒(6 mg/kg)经尾静脉注射到荷瘤小鼠体内。使用7.0TMAGNETOM Skyra 磁共振成像系统(Philips)对不同浓度的MSNMn-GOx纳米颗粒溶液(50、100、150、200、250 g/mL)和注射MSNMn-GOx纳米颗粒前后的小鼠进行T1加权序列扫描,获得MRI成像图片。1.6 细胞培养胃肠癌细胞(AGS和HT-29)购自中科院上海细胞库,使用含10%胎牛血清的DMEM培养基、置于37 5%CO2培养箱中进行培养。每24 h更换1次培养基,细胞密度超过70%时,以0.2
19、5%胰酶消化进行传代培养。取对数生长期的胃肠癌细胞进行体外实验,实验分为Control组(PBS)、MSNMn组(20g/mLMSNMn纳米颗粒)和MSNMn-GOx组(20 g/mLMSNMn-GOx纳米颗粒)。1.7 激光共聚焦实验胃肠癌细胞(AGS和HT-29)按10 000/孔接种于共聚焦培养皿,细胞贴壁后分别加入 MSNMn 和MSNMn-GOx纳米颗粒(均为20 g/mL),常规培养24 h后按照检测试剂盒说明书加入DCFH-DA绿色荧光探针,37 避光孵育30 min,加入含DAPI的抗荧光淬灭封片液,激光共聚焦显微镜(Olympus)下观察细胞内的荧光强度。1.8 CCK-8细
20、胞毒性实验胃肠癌细胞(AGS和HT-29)按1000/孔接种于96孔板,细胞贴壁后分别加入不同浓度的MSNMn和MSNMn-GOx纳米颗粒(均为0、2、4、16、25、50g/mL)并继续培养24 h,加入10 LCCK-8试剂,37 孵育2 h,酶标仪设置450nm波长测定吸光度A450nm。1.9 Edu细胞增殖实验胃肠癌细胞(AGS和HT-29)按10 000/孔接种于共聚焦培养皿,细胞贴壁后分别加入 MSNMn 和MSNMn-GOx纳米颗粒(均为20 g/mL),常规培养24 h 后加入含 10 mol/L EdU 染液,继续孵育 2 h;http:/www.j-J South Med
21、 Univ,2023,43(8):1432-14391433EdU标记细胞完成后加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定30 min;继续加入0.5%Triton X-100孵育10 min,最后加入DAPI染液,室温避光孵育10 min,激光共聚焦显微镜下观察细胞内的荧光强度。1.10 统计学分析所有数据均采用IBM SPSS 20.0处理。计量资料以均数标准差表示,两组间数据比较采用t检验,多组间数据比较采用单因素方差分析,组间数据比较采用LSD-t检验。以=0.05为检验水准,对以上结果均进行双侧检验,P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 MSNMn-GOx的理化特征透 射 电 镜
22、图 显 示(图 1A、B),MSNMn 及MSNMn-GOx纳米颗粒均为直径约100 nm的实心圆球。透 射 电 镜 下 的 EDS 能 谱 分 析 结 果 显 示:MSNMn-GOx纳米复以硅(Si)及锰(Mn)元素为主(图1C)。电感耦合等离子体质谱分析仪ICP分析结果显示:MSNMn-GOx中锰的含量约为25%。光电子能谱仪XPS分析结果显示:MSNMn-GOx在641.37eV和653.26 eV处有归属于Mn 2p3/2和Mn 2p1/2的特殊吸收峰,MSNMn-GOx纳米复合物大部分为二价态的 Mn(II)(图 1D)。马尔文粒径仪测定显示,MSNMn及MSNMn-GOx纳米颗粒的
23、水合平均粒径均约为100 nm(图1E),平均Zeta电位分别为-32 mV及-35mV(图1F)。图1 MSNMn和MSNMn-GOx纳米颗粒的理化特征Fig.1 Physicochemical features of MSNMn and MSNMn-GOx nanoparticles.A:MSNMn nanoparticles under transmissionelectron microscope(TEM).B:MSNMn-GOx nanoparticles under TEM.C:Energy dispersive spectroscopy(EDS)of MSNMn-GOx.D:X-
24、ray photoelectron spectroscopy(XPS)of MSNMn-GOx.E:Particle size of MSNMn and MSNMn-GOx.F:ZetapotentialofMSNMnandMSNMn-GOx.DIntensity(a.u.)660650640B.E.(ev)RawSumBackgroudPeak1Peak2Peak3Peak4Mn2p1/2=653.26 eVMn2p3/2=641.37 eVCFABE100 nm100 nmMSNMnMSNMn-GOxIntensity20151050MSNMnMSNMn-GOxMSNMn MSNMn-GO
25、xZeta potential(mV)0-10-20-30-40-502.2 MSNMn-GOx的类芬顿催化能力同 样 H2O2浓 度 的 条 件 下,不 同 pH 溶 液 的MSNMn-GOx展示出不同的吸光度。相比于pH=7.4的Control组,pH=7.4的溶液中加入MSNMn-GOx纳米颗粒后其吸光度明显下降,而加入MSNMn-GOx纳米颗粒的pH=6.0溶液,其吸光度进一步下降(P0.05,图2A)。氧消耗实验显示:MSNMn-GOx与葡萄糖混合后,培养液中溶解的氧气水平随着时间的延长而降低(图2B)。2.3 MSNMn-GOx的核磁成像能力MRI成像结果显示:相比于Control
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