绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定.pdf
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1、第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.4Aug.2023收稿日期:2022-09-29 基金项目:国家自然科学基金项目(31860725)作者简介:袁利明(1996),男,硕士研究生,专业方向为动物胚胎工程。通信作者:赛务加甫(1962-),教授,从事动物胚胎工程方面的研究,e-mail:291016059 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.034文章编号:1007-7383(2023)04-0441-08绵羊 P
2、LC-1 基因真核表达载体的构建及鉴定袁利明1,2,陈云蕾3,刘素平1,丁林玲3,吴兰3,赛务加甫1(1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832000;2 西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100;3 桐庐无规定马属动物疫病区管理中心,浙江 杭州 310000)摘要:目的 旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊 PLC-1 非融合性真核表达载体。方法 在原有PUC57-PLC-1 克隆载体基础上,对目的片段 N 端前加入 P2A 序列和 3 个连续 Flag 序列后使用 Hind 酶和 Sal 酶双酶切获得 P2A-3Flag-PLC-1 片段,将其连接至 pDsRed2-C
3、1 载体获得重组质粒 pDsRed2-C1-P2A-3Flag-PLC-1;然后采用 Lip 2000 转染试剂将该重组质粒转染至 HEK-293T 细胞,最后利用荧光显微镜、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀(IP)和免疫荧光(IF)法鉴定重组质粒 pDsRed2-C1-P2A-3Flag-PLC-1 的表达及亚细胞定位情况。结果 双酶切和测序结果显示质粒 pDsRed2-C1-P2A-3Flag-PLC-1 构建成功,观察到红色荧光;免疫荧光的亚细胞定位检测出 PLC-1 蛋白在细胞质中表达;qRT-PCR 和 Western blotting 法均能检测出 PLC-1
4、表达,与对照组有显著性差异(P0.01);免疫共沉淀也纯化分离出含有 Flag 标签的 PLC-1 蛋白。结论 本研究成功构建绵羊 PLC-1 基因的真核表达载体,在 P2A 肽作用下实现目的蛋白 PLC-1 与 DsRed2 的表达,构建的载体可用于研究 PLC-1 在早期胚胎发育中的作用。关键词:P2A 肽;PLC-1;绵羊;HEK-293T 细胞;Flag 标签中图分类号:S858.26文献标志码:AConstruction and identification of eukaryotic expression vector of Sheep PLC-1 geneYUAN Liming1
5、,2,CHEN Yunlei3,LIU Suping1,DING Linling3,WU Lan3,Saiwujiafu1(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China;2 North West Agriculture and Forestry University,Yangling,Shanxi 712100,China;3 Tonglu Equine Disease Free Zone Management Center,Hangzhou,Zhejian
6、g 310000,China)Abstract:Objective To construct sheep PLC-1 with red fluorescent protein(RFP)reporter gene non-fusion eukaryotic expression vector.Method It is based on the original cloning vector of PUC57-PLC-1,P2A-3Flag-PLC-1 was obtained by adding P2A se-quence and three consecutive Flag sequences
7、 before the N-terminal of the target fragment and using Hind enzyme and Salenzyme fragment.And then connect it to the pDsRed2-C1 vector to obtain recombinant plasmid pDsRed2-C1-P2A-3 Flag-PLC-1;After that,the recombinant plasmid is transfected into HEK-293T cells with Lip 2000 transfection reagent.F
8、inally,the expression and sub-cellular localization of the recombinant plasmid pDsRed2-C1-P2A-3 Flag-PLC-1 can be identified by fluorescence microscopy,qRT-PCR,Western blot,immunoprecipitation(IP)and immunofluorescence(IF)methods.Results The results of double digestion and sequencing showed that the
9、 plasmid pDsRed2-C1-P2A-3 Flag-PLC-1 was successfully constructed and the red fluorescence was observed;The expression of PLC-1 protein can be detected of by the subcellular localization of immunofluorescence;Both the methods of qRT-PCR and Western blotting can detect PLC-1 expression,and there was
10、a significant difference between the control group and the control group(P0.01);Immunocoprecipitation also purified and isolated the PLC-1 protein with Flag tag.Conclusion This study successfully constructed sheep PLC-1 gene eukaryotic expression vector,realizing the expression of the target protein
11、 PLC-1 and DsRed2 under the action of P2A peptide.The constructed vector can be used to study PLC-1 in early embryo development.Key words:P2A peptide;PLC-1;Sheep;HEK-293T cells;Flag tags442 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C(PLC)是与大多数细胞受体激活相关的常见信号成分1。PLC-1 作为 PLC 的一个亚型,可将磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸(PIP2)转化为肌醇 1,4,
12、5-三磷酸(IP3)和甘油二酯(DAG),由于 DAG 和 IP3 各自控制不同的细胞过程,也是合成其他重要信号分子的底物2;在细胞增殖与分化3、细胞运动4、受精过程中的精卵识别5、淋巴细胞的活化肿瘤侵袭和转移6和机体生长发育等生命过程中发挥重要作用7。PLC-1在 PLC 中是独特的,是由受体酪氨酸激酶(RTK)磷酸化直接激活并在 PLC-1 的 Tyr 783 位点上磷酸化,这种磷酸化是刺激磷脂酶活性的典型条件8。Hajicek 等人9构建的磷酸化诱导 PLC-1 活化的模型显示,PLC-1 的 nSH2 结构域介导自抑制酶向活化的受体酪氨酸激酶,以成纤维细胞生长因子受体 1(FGFR1)
13、的激活为例,如图 1 所示的募集引起PLC-1 空间构型的改变,从而发脂肪酶的磷酸化依赖性激活。Ma 等10通过敲除斑马鱼胚胎中的morpholino(MO)基因发现胚胎发育过程中 PLC-1在细胞生成中具有重要调控作用。尽管初步研究表明 PLC-1 在早期胚胎发育具有重要作用,但涉及的分子机制鲜有报道。图 1通过 FGFR1 引发 PLC-1 的激活机制示意图9 2A 肽(猪圆环病毒)是一类自剪切序列,称为“顺式作用元件水解酶”,含有 18 到 22 个氨基酸,在翻译到它的时候会断开,能够有效介导核糖体跳跃,通 过 自 我 切 割 实 现 上 下 游 两 个 蛋 白 单 独 翻译11-12;
14、可以把同一条 mRNA 表达出的蛋白前后分开产生两个蛋白,用于构建多顺反子载体,实现同一个启动子控制下的两蛋白共翻译,形成非融合性蛋白13-14。同时,非融合性蛋白在结构和功能方面会基本一致,保持原有的免疫原性15。在构建载体同时,pDsRed2-C1 载体上的 DsRed2 红色荧光蛋白为之后的转染提供了很好的依据,这为研究该基因的功能提供了更好的工具载体。因此,本研究拟通过携带红色荧光蛋白(RFP)报告功能和 2A 肽的切割作用构建出活性更好的绵羊 PLC-1 非融合性真核表达载体,从而在不影响蛋白空间功能及活性基础上实现 PLC-1 蛋白表达,为后续研究绵羊 PLC-1 基因在绵羊早期胚
15、胎发育分子机制研究上提供基础和便捷。1 材料与方法1.1试验材料1.1.1载体与细胞PUC57-PLC-1 载体(本实验室已构建载体)、带有红色荧光蛋白的 pDsRed2-C1 载体、HEK-293T细胞,作者已构建好的 PUC57-PLC-1 载体,DH5感受态细胞以上皆由动物疾病防控兵团重点实验室保存提供。1.1.2主要试剂和设备质粒小提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、胶回收试剂盒、Marker II、增强型 HRP-DAB 底物显色试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;增强型 ECL 化学发光检测试剂盒(即用型)购置诺唯赞生物科技股份有限公司;Blue Plus IV Protei
16、n Marker(10-180 kDa)购置于北京全式金生物科技有限公司;SDS-PAGE 上样缓冲液、2Taq MasterMix(Dye)购置于康为世纪生物科技有限公司;DL10000 DNA Marker、总提 RNA 试剂盒、反转录(Perfect Real Time)试剂盒、Hind 酶和 Sal酶均购置宝日医生物科技(北京)有限公司。细胞裂解液、PMSF、PBS、胰酶、DAPI、HRP 标记二抗(羊抗兔)、FITC 标记二抗(羊抗鼠)均购置北京索莱宝科技有限公司;Qua-ntStudio 5 实 时 荧 光 定 量 仪、Lip 2000、PageRuler?Prestained P
17、rotein Ladder(10-180 kDa)购置于赛默飞世尔科技公司;PLC-1 一抗(羊抗兔)、-actin一抗(羊抗兔)、Flag 一抗(羊抗鼠)、SYBR 染料、Flag 磁珠、磁力架均购置于美国 Bimake 生物科技有限公司;犊牛血清、DMEM 购置于 BI 公司。1.2方法1.2.1重组 PLC-1 序列的设计及合成基于获取的绵羊 PLC-1 基因序列,在 N 端前加入 P2A 序列及 3 个连续 Flag 序列,两端分别加入Hind 和 Sal 酶 切 位 点 粘 性 末 端。根 据 pD-sRed2-C1 载体图谱,在 Hind 酶切位点添加 cg 两个碱基,以保护蛋白正
18、常翻译(表 1)。将设计好的第 4 期袁利明,等:绵羊 PLC-1 基因真核表达载体的构建及鉴定443 序列及含 PUC57-PLC-1 载体的菌液送至上海生工股份有限公司合成,并连接在 PLC-1 基因两端并纯化至 PUC-57 载体上。表 1合成序列基因序列(53)P2A 片段GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTFlag 片段GATTACAAGGATGACGACGATAAG1.2.2重组 pDsRed2-C1-P2A-3Flag-PLC-1 表达载体的构建PUC57-P2A-3Flag-PLC-
19、1 载体和 pDsRed2-C1 载体用限制性内切酶 Hind 和 Sal双酶切,酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收并纯化。纯化后用 T4 连接酶将 P2A-3 Flag-PLC-1 片段 与酶切后的 pD-sRed2-C1 空载质粒连接,并转化到 DH5 感受态细胞,涂布在卡那抗性的固体 LB 平板。16 h 后挑单克隆菌株、摇菌并菌液 PCR 反应鉴定,以待检单克隆菌落为模版,以 PUC57-P2A-3Flag-PLC-1 为引物。PCR 扩增体系 25 L:待检单克隆菌落 2 L,2Taq MasterMix(Dye)12.5 L,上、下游引物各 0.5
20、 L,ddH2O 9.7 L。PCR 反应条件:95 预变性 5 min;94 变性 40 s,56 退火 30 s;72 延伸 60 s,共 30 个循环;72 延伸 10 min,引物如(表 2)。将菌液 PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将具有特异性条带的单克隆菌落保菌送至上海生工股份有限公司测序。表 2菌落 PCR 引物合成引物序列(53)片段大小/bpP2A-3Flag-PLC-1F:AGAGTACCCGGTCATCCTGTCR:ATTGCAGCGCAGGGGAA7271.2.3重组质粒转染 HEK-293T 细胞将测序正确的 pDsRed2-C1-PLC-1 重组表达质粒
21、和 pDsRed2-C1 空载质粒进行菌液活化培养,并用天根去内毒素大提质粒试剂盒进行大提质粒。用脂质体 Lip 2000 将重组质粒和空载质粒各 4 g、ddH2O 4 L 转染到 HEK-293T 细胞中,24 h 后在体视荧光显微镜下观测转染情况并记录。1.2.4实 时 荧 光 定 量 检 测 HEK-293T 细 胞 中PLC-1 mRNA 的相对表达量待转染 24 h 后用 PBS 洗涤,并加入 500 L Buffer RL 吹打细胞转移至 2 mL 无酶离心管内,按照 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 说明书提取实验组 pD
22、sRed2-C1-PLC-1、pDsRed2-C1、ddH2O 对照组细胞的总 RNA。按照 TaKaRa Pri-meScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录,并去除基因组 DNA。根据绵羊-actin 基因(登录号:443052)和绵羊 P2A-3Flag-PLC-1 基因序列设计实时荧光定量 qPCR 引物(表 3)。实时荧光定量 qPCR 反应体系为 20 L,反应体系:2SYBR Green qPCR Master Mix 10 L,cDNA 1 L,PLC-1/-actin-qPCR-F(
23、10 molL-1)0.8 L,PLC-1/-actin-qPCR-R(10 mol L-1)0.8 L,50ROX Reference Dye(low Donc)0.4 L,ddH2O 7 L;利用 Quant StudioTM De-sign&Analysis Software 软 件 设 计 实 时 荧 光 定 量qPCR 反应程序试验采用相对定量反应程序为:95 预变性 10 min,95 变性 15 s,60 1 min 45 个循环,最后 95 变性 15 s,60 1 min,95 变性15 s 以获得溶解曲线。每组样品均重复 3 次试验。表 3实时荧光定量 qPCR 引物合成引
24、物序列(53)片段大小/bpPLC-1-qPCRF:TACCACGCCAGCCTGACCR:CTCGTTCCGTTTCCGCACCAG90-actin-qPCRF:CCATCGGCAATGAGCGGTTCCR:CCGTGTTGGCGTAGAGGTCTTTG1471.2.5Western blot 鉴定 3Flag-PLC-1 蛋白表达将转染 48 h 后的 3 组细胞用 PBS 洗涤 3 遍,250 L RIPA(含 1 mmol L-1 PMSF)洗脱至 1.5 mL离心管中,4 冷却 30 min,14 000 g 离心 5 min;按照索莱宝 BCA 蛋白浓度测定试剂盒将 3 组蛋白浓度
25、稀释统一浓度。取 16 L 样品加入 4 L 5Load-ing buffer 蛋白上样,混匀后于金属浴 100 煮沸 5 min,进行 SDS-PAGE 聚丙烯胺凝胶电泳。将样品转至 PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭 2 h,PBST 漂洗滤膜 3 次,每次 10 min,以兔抗 PLC-1 单抗为一抗(11 000 倍稀释)4 过夜孵育,然后 PBST 漂洗滤膜 3 次,每次 10 min,以辣根过氧化物酶标记好的羊抗兔 HRP-IgG 为二抗(1 10 000 倍稀释)室温孵育 2 h,再用 PBST 漂洗滤膜 3 次,每次 10 min,按照说明书配制 ECL 发光液,点滴在 PVDF
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