具核梭杆菌调控炎症相关结直肠癌炎症微环境的机制.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.003第一作者简介:张 银,在 读 硕 士,住 院 医 师,研 究 方 向:消 化 道 肿 瘤。E-mail:hnnythzy 通讯作者:张英剑,教授,主任医师,博士生导师,研究方向:消化系统疾病的研究与诊治工作。E-mail:zyjhkdyfy1268 具核梭杆菌调控炎症相关结直肠癌炎症微环境的机制张银1,王萍2,杜笑语1,康莹莹1,邓子刚1,张英剑11.河南科技大学临床医学院,河南科技大学第一附属医院消化内科,河南 洛阳 471003;2.河南科技大学基础医学与法医学院预防医学教研室【摘要】目的探讨具核梭杆菌调控炎症
2、相关结直肠癌炎症微环境的作用机制。方法采用 qPCR 和免疫组化检测不同结直肠组织中具核梭杆菌的表达和 IL-1 的表达;基于 TCGA 数据库分析炎症因子在各种肿瘤组织中的表达;ELISA 检测具核梭杆菌感染对髓系 THP-1 细胞培养上清液 TNF-、IL-6、IL-1 表达的影响。结果与溃疡性结肠炎组、结直肠腺瘤组和健康对照组相比,结直肠癌组织中具核梭杆菌的丰度明显增加(P0.05);在结直肠癌组织中,多种炎症因子水平高于癌旁正常组织(P0.05);IL-1 明显表达于炎症相关结直肠癌组织中,并与具核梭杆菌感染呈正相关。具核梭杆菌感染使 THP-1 细胞分泌 TNF-、IL-6、IL-1
3、 水平明显升高(P0.05),且随着感染时间的延长,TNF-、IL-6、IL-1 的水平逐渐升高。结论具核梭杆菌可能通过上调结直肠癌髓系细胞 IL-1 等炎症细胞因子的表达,调控肿瘤炎症微环境,从而促进结直肠癌的发生发展。【关键词】结直肠癌;具核梭杆菌;细胞因子;炎症微环境中图分类号:R735.3文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0852-06收稿日期:2022-09-17Mechanism of Fusobacterium nucleatum regulating the inflammatory microenviron-ment of colitis assoc
4、iated colorectal cancerZHANG Yin1,WANG Ping2,DU Xiaoyu1,KANG Yingying1,DENG Zigang1,ZHANG Yingjian11.College of Clinical Medicine,Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Henan University of Sci-ence and Technology,Luoyang 471003;2.Department of Preventive Medicine,College of
5、Basic Medicine and Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Fusobacterium nucleatum(Fn)regulating the inflammatory microenvironment of colitis associated colorectal cancer(CAC).MethodsThe expression of Fn and IL-1 in differe
6、nt colorectal tissues were detected by qPCR and IHC.The expression of inflammatory factors in various tumor tissues were analyzed based on TCGA database.The effects of Fn infection on the expression of TNF-,IL-6 and IL-1 in the super-natant of myeloid THP-1 cell culture were determined by ELISA.Resu
7、ltsCompared with ulcerative colitis group,colo-rectal adenoma group and healthy control group,the abundance of Fn in colorectal cancer tissues was significantly in-creased(P0.05).The levels of multiple inflammatory factors in colorectal cancer tissues were higher than those in ad-jacent normal tissu
8、es(P0.05).IL-1 was significantly expressed in CAC tissues,and was positively correlated with Fn infection(P0.05).Fn infection significantly increased the levels of TNF-,IL-6 and IL-1 secreted by THP-1 cells(P5%25%,2 级为25%50%,3 级为50%75%,4 级为75%;(5)阳性面积比=阳性面积/组织面积;(6)阳性面密度=IOD 值/组织像素面积。1.7ELISA 检测 TNF
9、-、IL-6、IL-1 水平将 Fn 与THP-1 细胞共培养的培养液吸出至 1.5 ml EP 管内,常温下 2 000 r/min,离心 5 min,后取上清液备用,按358胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8照 人 TNF-ELISA 检 测 试 剂 盒(E-EL-H0109c,Elabscience 公 司)、人 IL-6 ELISA 检 测 试 剂 盒(E-EL-H6156,Elabscience 公司)、人 IL-1 ELISA 检测试剂盒(E-EL-H014
10、9c,Elabscience 公司)说明书进行实验,用 ELISA 法测定上清液中 TNF-、IL-6、IL-1 的含量。用 PerkinElmerEnSpire 多功能酶标仪在 450 nm波长测定 OD 值,根据绘制的标准曲线计算 TNF-、IL-6、IL-1 三种炎症因子含量(ng/ml),换算成 pg/ml作图。1.8统计学方法采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析,计量资料以 xs 表示。组间比较采用单因素方差分析、独立样本 t 检验,计数资料以例数/%表示,组间比较采用2检验或 Fisher 确切概率法检验。双侧检验水准=0.05,P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1
11、Fn 在不同人群结直肠组织的定植情况通过qPCR 方法分析比较了不同结直肠组织中 Fn 的丰度情况,发现在 CAC 组 Fn 的表达丰度较高,与 UC 组、CRA 组及健康对照组相比,差异有统计学意义(P 0.05);UC 组、CRA 组 Fn 的丰度明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05,见图 1)。注:P0.05,P0.01。图 1Fn 在不同结直肠组织中的表达丰度Fig 1Expression abundance of Fn in different colorectal tissues2.2TCGA 数据库分析 IL-6、IL-1、TNF-在各种肿瘤组织中的表达情况TCGA
12、数据库分析结果显示,在 COAD 和 READ 中,IL-6、IL-1、TNF-的表达量与癌旁正常组织相比均显著升高(P 0.05,见图2)。IL-6、IL-1、TNF-可以作为肿瘤标志物,对于CAC 患者的诊断可能具有一定的潜在价值。注:A:IL-6;B:IL-1;C:TNF-。图 2IL-6、IL-1、TNF-在不同肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达情况Fig 2Expressions of IL-6,IL-1 and TNF-in different tumor tissues and adjacent normal tissues458胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第
13、 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.82.3IL-1 在不同结直肠组织中的表达情况及 CAC组织中 IL-1 表达与 Fn 感染的相关性免疫组化结果显示,IL-1 少量表达于健康对照组结肠腺上皮细胞胞浆中,在 UC 组、CRA 组腺上皮细胞胞浆中表达较健康对照组高,且明显表达于 CAC 腺癌细胞胞浆中(P 0.05,见 图 3)。四 组 阳 性 细 胞 比 率 分 别 为38.08%、53.30%、67.84%及 90.85%。IL-1 在 Fn 感染的 CAC 组织中的阳性表达率为 85.71%(12/14),明显高于无感染
14、组 33.33%(3/9),差异有统计学意义(P0.05,见表 1)。图 3IL-1 在健康对照组、UC 组、CRA 组及 CAC 组结直肠组织中的表达情况(放大 200 倍)Fig 3Expression of IL-1 in colorectal tissues of healthy control group,UC group,CRA group and CAC group表 1CAC 组织中 IL-1 表达与 Fn 感染的相关性Tab 1 The correlation between IL-1 expression and Fn infection in CAC tissueFn 感
15、染 例数 IL-1 表达 阴性 阳性2值P 值阴性 9 6 3 6.626 0.023阳性 14 2 122.4Fn 感染对髓系 THP-1 细胞炎症因子表达的影响结果显示,Fn 感染组细胞培养上清液 IL-1 水平明显高于对照组(P0.05,见图 4A);Fn 感染组细胞培养上清液 IL-6 水平明显高于对照组(P0.05,见图4B);Fn 感染组细胞培养上清液 TNF-水平明显高于对照组(P0.05,见图 4C);髓系 THP-1 细胞被 Fn 感染后,随着感染时间的延长,细胞培养上清液中 TNF-、IL-6、IL-1 水平逐渐升高(见图 4D)。3讨论随着近些年来肠道菌群微生态的应用前景
16、逐渐广阔,Fn 与 IBD、CRC 肿瘤免疫及炎症微环境的关系成为国内外众多学者研究的热点。研究证实,Fn 可通过诱发结直肠组织炎症及抑制宿主免疫反应促进 CRC的发生7。Fn 可以存在于任何组织学类型的结直肠癌前病变中8,Strauss 等9发现 Fn 在 IBD 患者肠道黏膜中呈富集现象,而 IBD 与 CRC 的发生密不可分,这就提示 Fn 可能在 CAC 的发生过程中起到重要的作用。在本研究中通过收集 CRC 癌前疾病:UC、CRA、CRC 及健康对照者结直肠组织标本,采用 qPCR 的方法验证了 Fn 在 UC、CRA 及 CAC 组织中的表达,且与正常组、UC 组及 CRA 组相比
17、,CRC 组织中 Fn 呈明显富集现象。基于 TCGA 数据库,本研究分析了炎症因子 IL-6、IL-1、TNF-在不同癌症及对应癌旁组织中的表达情况,结果显示在 CRC 中,这些炎症因子的表达量与癌旁正常组织相比显著升高。免疫组化分析结果表明 IL-1 少量表达于健康对照组结肠腺上皮细胞胞浆中,在 UC 组、CRA 组腺上皮细胞胞浆中表达较健康对照组高,且明显表达于 CAC 细胞胞浆中。这提示这些炎症因子可以作为标志物,对于 CAC 患者的诊断可能具有潜在价值。IBD 是一种慢性反复发作的炎症性疾病,与肠道免疫和肠道微生物群的改变密切相关10,事实上慢性炎症也与机体的免疫细胞密不可分,包括:
18、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。在炎症微环境中,巨噬细胞和效应 T 细胞可被激活,进而释放大量的炎性细胞因子如 TNF-、IL-6、IL-17 等,这些炎症因子可通过损伤细胞 DNA、沉默肿瘤抑制因子、影响多种信号通路等促进 CAC 的发生进展。目前的研究证实免疫细胞亚群及炎症因子能够促进突变肠道上皮细胞凋亡,起到抑制肿瘤的作用;但当炎症持续存在,炎症的微环境形成后,机体的免疫监视功能会因炎症微环境的改变而减弱,进而导致调节性 T 细胞 Treg 细胞减少11,肠道组织就会朝着恶变的方向发生发展。研究5表明,UC 及 CD 均表现出炎症细胞因子IL-1、IL-6、IL-8 的增多,本研究也
19、证实了 IL-1 在 UC患者、CRA 患者及 CRC 患者结直肠组织中的高表达,高水 平 的 IL-1 也 与 IBD 的 疾 病 活 动 密 不 可 分。IL-1 主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞合成并分泌,在肿瘤免疫及炎症微环境中发挥着重要作用,其通558胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8注:A:IL-1 水平;B:IL-6 水平;C:TNF-水平;D:三种炎症因子水平随感染时间的变化。图 4IL-6、IL-1、TNF-在 Fn 感染组和对照组的表达水平Fig 4E
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