基于转录组测序技术挖掘长吻生长关键基因.pdf
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1、第 44 卷 第 5 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.44,No.5 2 0 2 3 年1 0 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Oct.,2023 *国家自然科学基金(31402302)、重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxmX0837)、重庆市水产科技创新重点攻关项目和重庆市大学生创新创业训练计划(S202110635274)共同资助。李 雨,E-mail: 通信作者:叶 华,教授,E-mail: 收稿日期:2022-04-13,收修改稿日期:2022-06-01 DOI:10.19663/j.issn2095-9869.2022041300
2、1 http:/ LI Y,LING L Y,JIN H H,LI Z,GAO Y,LIU F,LUO H,YE H.Mining of key genes related to growth of Chinese longsnout catfish(Leiocassis longirostris)based on transcriptome analysis.Progress in Fishery Sciences,2023,44(5):125136 基于转录组测序技术挖掘长吻生长关键基因*李 雨 凌乐妍 金鸿浩 李 哲 高 源 刘 蕃 罗 辉 叶 华(西南大学水产学院 淡水鱼类资源与生殖发
3、育教育部重点实验室 重庆 402460)摘要 为挖掘我国名优鱼类长吻(Leiocassis longirostris)生长相关基因,本研究运用 Illumina 高通量测序技术比较分析了快速生长组平均体质量为(534.0253.68)g和缓慢生长组平均体质量为(108.414.96)g各9尾长吻的脑组织基因表达谱。测序共获得267 404 674个高质量测序片段(clean reads),通过 2 种不同生长速率长吻脑组织转录组比较筛选出 518 个差异表达基因,其中,412 个基因表达量上调,106 个基因表达量下调。对 12 个差异表达基因进行实时荧光定量 PCR 验证的结果与转录组测序结
4、果一致。GO 功能分类显示,大量差异表达基因富集到生长(growth)、生长因子活性(growth factor activity)和激素介导的信号通路(hormone-mediated signaling pathway)GO 条目中。KEGG 富集分析显示,一些差异表达基因在 MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、转化生长因子 信号通路(TGF-beta signaling pathway)、钙离子信号通路(calcium signaling pathway)和神经活性配体受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interacti
5、on)等途径中富集。根据 GO 功能注释和KEGG 富集分析,筛选出 gnrh、thr、egr1、fgf18、sst、gipr、cart 和 crf 等基因是调控长吻生长发育的关键候选基因。本研究结果为后续深入研究长吻生长调控机制提供了重要的参考资料。关键词 长吻;鱼类生长;转录组测序;神经内分泌因子 中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2023)05-0125-12 生长是养殖水产动物最具经济价值的性状之一,生长性能高的养殖鱼类往往能在满足人类食物需求的同时带来直接的经济效益。与哺乳动物相似,鱼类生长包括了能量代谢和肌肉生长等多种过程,主要受环境、基因以及基因
6、与环境相互作用的影响,是一个复杂的数量性状(Dai et al,2015)。目前,研究者们从肌肉生成和肝脏代谢过程的角度出发,已挖掘出多种鱼类的生长相关基因和生长调控机制。如王兰梅等(2021)确定了 mb、my12b 和 tnnil 等 6 个基因为福瑞鲤 2 号(Cyprinus carpio)肌肉生长的关键基因;Li 等(2022)初步证明禾花鲤(Cyprinus carpio)生长差异可能是由于蛋白质沉积引起肌纤维肥大所致,进而表明了泛素蛋白酶体途径是影响禾花鲤生长的重要因素;Zhang 等(2021)在草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝脏组织中鉴定出的 ghr、
7、igf1 和 igf1r 主要在PI3K-Akt 和 mTOR 信号通路中参与生长调控。然而,下丘脑可直接或间接地对机体生理节律、摄食、繁殖和生长等生命活动进行调控,是代谢过程和内分泌活动的重要神经调节中枢(Pirkowska et al,2020)。一些神经内分泌因子(GH、GnRH、NPY、THR、CCK 和SST 等)和神经调控轴也对鱼类的生长调节起着不可或缺的作用(Canosa et al,2007、2020;Dai et al,2015;126 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 Li et al,2010;Christian et al,2007;Peng et al,1997)
8、。因此,利用脑组织开展鱼类生长的研究有利于分析生长相关的神经内分泌调控网络及关键基因。转录组测序技术有助于深入探究细胞中基因的转录和转录调控。近年来,转录组学技术已广泛应用于水产动物免疫应答(Xue et al,2021)、生长发育(Liu et al,2020)、生物进化(Schunter et al,2014)和环境适应(Yao et al,2021)等方面的研究,有效地进行了功能基因挖掘、特异性状主效基因搜索和基因表达调控等研究(Ye et al,2018;罗辉等,2015)。转录组测序技术的运用在很大程度上满足了水产动物生长发育相关功能基因和调节机制研究的需要,已在多种鱼类中确定了与生
9、长相关的候选基因及其表达模式(王兰梅等,2021;Lu et al,2020;Tian et al,2020;Lin et al,2019)。长吻(Leiocassis longirostris)是我国名贵淡水经济鱼类之一,曾广泛分布于辽河、黄河、淮河、长江、珠江和岷江(Xiao et al,2009)。因其肉质鲜美、口感爽滑、无肌间刺、含肉率高,且肌肉中粗蛋白和鲜味氨基酸总量高于青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼和鳙鱼(Aristichthys nobilis)等常见食用鱼类,而深受广大消费者的喜爱(张升利等,2013)。2020 年我国长吻年产量接近 2.12 万
10、t(农业农村部渔业渔政管理局等,2021),在名优经济鱼类养殖中占有重要地位。目前,关于长吻的报道多见于对养殖环境条件的免疫应答(Han et al,2011;Zhao et al,2009;Han et al,2005)和营养与饲料等方面(Su et al,2020;Pei et al,2015;Dong et al,2011;Zhu et al,2005),其生长相关的关键基因未见报道,生长的分子调控机制尚不清晰。本课题组近两年在长吻染色体水平基因组组装(He et al,2021)、生长相关 SNP标记开发(Zhao et al,2020)以及形态性状与体质量的关系(李哲等,2021)方
11、面做了大量工作。在此基础上,本研究拟采用高通量测序技术对生长速率呈现极端差异的长吻个体脑组织转录组进行比较分析,旨在筛选出与长吻生长相关的候选基因,以期为长吻生长性状改良以及后续基因的功能研究提供参考依据。1 材料与方法 1.1 实验鱼与样品采集 实验用长吻采自四川省农科院水产研究所宜宾基地。随机选取 200 尾 30 月龄同一批次繁殖、同一个池塘养殖的长吻,依次用低剂量 MS-222 麻醉后,称量体重并记录数据。根据体质量选取其中 9 尾极大个体作为快速生长组(fast-growing,FG),9 尾极小个体作为缓慢生长组(slow-growing,SG)(表 1)。解剖判定性别后,快速分离
12、出脑组织,充分浸泡于 Sample Protector for RNA/DNA(TaKaRa)中,过夜后置于80 冰箱保存备用。表 1 长吻体质量测定结果(g,平均值标准差)Tab.1 Body mass of L.longirostris(g,MeanSD)项目 Items 雌性 Female 雄性 Male 均值 Mean 快长组 FG534.3864.98515.3021.57 534.0253.68慢长组 SG105.724.75 111.782.88 108.414.96均值 Mean344.44233.16 284.71216.06 1.2 长吻脑组织总 RNA 提取 参照 TRI
13、zol 试剂(Invitrogen,美国)的操作说明提取 18 尾长吻脑组织的总 RNA,并用 DNase(TaKaRa)去除总 RNA 中的基因组 DNA。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测 RNA 完整性及总量,Qubit 2.0 Flurometer(Life Technologies,美国)测定总 RNA 浓度。所提取的总 RNA 一部分用于转录组测序,另一部分用于后续实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)验证。1.3 cDNA 文库构建与测序 分别从 2 个组中随机选择 3 个个体 RNA 等量混合,通过带有 Oligo(dT)的磁珠富集 mRNA 后,用F
14、ragmentation Buffer 将 mRNA 随机打断,再以片段化的 mRNA 为模板合成 cDNA 第一链和第二链。合成的双链 cDNA 经纯化后,先进行末端修复、加 A尾并连接测序接头,再用 AMPure XP beads 筛选370420 bp 左右的 cDNA 片段进行 PCR 扩增并纯化扩增产物,最终构建长吻 FG 组和 SG 组脑组织文库各 3 个,标记为 FG1、FG2、FG3 和 SG1、SG2、SG3。质检合格的文库最终进行 Illumina NovaSeq 6000 上机测序,测序读长为双端 150 bp。文库构建和转录组测序工作均由诺禾致源生物信息科技有限公司(天
15、津)完成。1.4 转录组测序质量控制 测序获得的原始数据(raw reads)中包含少量带有接头或测序质量较低的 reads,为保证转录组分析质量及有效性,需对原始数据进行过滤。具体包括:剔除由于测序仪器误差和人为因素导致的低质量 reads(QPhred20 的碱基数占整个 read 长度的 50%以上);去除含 N(无法确定碱基信息)比率超过 10%的 reads;识别并切除带有接头序列的 reads。第 5 期 李 雨等:基于转录组测序技术挖掘长吻生长关键基因 127 1.5 基因功能注释和基因差异表达分析 使用 HISAT2(v2.0.5)软件将 clean reads 与长吻参考基因
16、组(He et al,2021)进行比对,以获取 reads在参考基因组上的定位信息。根据 FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)值估计 FG 组和 SG 组的基因表达量。利用 DEGseq2(v1.20.0)软件进行 FG 组和 SG 组之间的差异表达分析,差 异 基 因 筛 选 阈 值 为 P1。通过 clusterProfiler(v3.4.4)软件实现差异表达基因的 GO 功能注释和 KEGG 富集分析。1.6 qRT-PCR 验证 选取 12 个差异倍数较大的差异表达基因进行qRT-PCR
17、,验证测序结果的准确度,相关引物见表 2。参照PrimeScriptTM RT-PCR(TaKaRa)试剂盒说明书进行逆转录,获得对应 cDNA,以-actin 为内参基因,在 ABI QuantStudio 3 Real-Time PCR 系统上进行,每个样品的技术重复均为 3。反应体系为 10 L:5 L 2TB Green Premix Ex Taq (TaKaRa),0.2 L ROX Reference Dye (50),3 L 灭菌水,1 L cDNA模板和上下游引物各 0.4 L(10 mol/L)。反应条件:预变性 95 30 s;95 5 s,60 34 s,40 个循环;9
18、5 15 s,60 1 min,95 15 s。1.7 数据统计及分析 体质量测定数据均以平均值标准差(MeanSD)表示,并采用 SPSS 26.0 软件进行独立样本 T 检验,P0.05 表示差异极显著。qRT-PCR 验证数据以 2Ct法计算基因的相对表达量,并采用 SPSS 26.0 软件对结果进行统计分析。表 2 验证所用引物信息 Tab.2 The information of primers used for validation 基因 ID Gene ID 基因名称 Primer name log2(FG/SG)引物序列 Primer sequence(53)Llo_GLEAN
19、_10001713 内参基因(-actin)Beta-actin 0.012 F:GAATCCCAAAGCCAACAG R:CAGAGCGTAACCCTCGTAG Llo_GLEAN_10019213 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因(afabp)Adipocyte-type fatty acid-binding protein 4.703 F:ATTTAGCCAAGCCAAGTCT R:TTACCATCCACCAGTTTCA Llo_GLEAN_10007485 同源异型盒蛋白基因(msx2)Homeobox protein MSX-2 4.469 F:GCAAGGTATGAGCACGGAGTT
20、R:TGGAGCAGACGGCTGGTAT Llo_GLEAN_10010013 成纤维细胞生长因子结合蛋白 1 基因(fgfbp1)Fibroblast growth factor binding protein 1 4.563 F:GGCATCACCCTGATTCTT R:GTGCTGCTGGATTTGGA Llo_GLEAN_10007293 成纤维细胞生长因子 18 基因(fgf18)Fibroblast growth factor 18-like 4.337 F:CGCCACGGGAGAAGATG R:GGCTTTCCTGCCAACCA Llo_GLEAN_10023206 小脑肽
21、2 基因(cbln2)Cerebellin-2-like 3.539 F:AACCGACAGACCATCCA R:GTTACTTGCCGCCTCAC Llo_GLEAN_10012820 含 DEP 结构域的蛋白 7 基因(depdc7)DEP domain containing 7 3.866 F:CAAACACCTCGCCAGTC R:AATCTCATCCACCAACTCTT Llo_GLEAN_10013292 神经胶质蛋白基因(gldn)Gliomedin 4.576 F:ACGAGAACATCATGGTGGCG R:CCTGCTTTGCTCTTCGGGTA Llo_GLEAN_100
22、08392 转录中介复合物亚基 31 基因(med31)Mediator complex subunit 31 4.242 F:AGAGGCTACCTACGAGAAA R:TCATCTATAAACTTGGCACA Llo_GLEAN_10001361 NADH 泛醌氧化还原酶亚基 10 基因(ndufa10)NADH:Ubiquinone oxidoreductase subunit A104.592 F:TTTCAGCGATGTGGTGTT R:CCTTTCCAGATGCCTTG Llo_GLEAN_10009731 生长激素抑制基因(sst)Somatostatin 7.343 F:GAG
23、TCGGAGTTTCAGGAGA R:GAGGTGGAAGGATGTTGG Llo_GLEAN_10018348 叉头框转录因子 D3 基因(foxd3)Forkhead box D3 4.999 F:AACTCCATCCGCCACAA R:GGGTCCAGCGTCCAGTA Llo_GLEAN_10022216 可卡因安非他明调节转录肽基因(cart)Cocaine-and amphetamine-regulated transcript protein 4.575 F:GGCACAGGAGGAAAGAG R:TCTCAGCGGATGGACTT 注:FG:快长组;SG:缓长组。Note:FG
24、:Fast-growing group;SG:Slow-growing group.128 渔 业 科 学 进 展 第 44 卷 2 结果 2.1 长吻体质量测定结果 所选 18 尾长吻中,FG 组包含 6 尾雌性个体和3 尾雄性个体,SG 组包含 5 尾雄性个体和 4 尾雌性个体。实验鱼体质量数据的独立样本 T 检验结果表明,雄性长吻和雌性长吻体质量的平均值无显著差异,且同一生长速率组中,雌、雄个体体质量平均值无显著差异;FG 组和 SG 组各 9 尾长吻体质量的平均值差异显著(P0.05)(表 1)。2.2 转录组测序结果 经转录组测序获得的 FG 和 SG 文库的 raw reads分别
25、为 134 682 652 和 137 487 704。质控后获得的clean reads 分别为 132 315 488 和 135 089 186。碱基质量及组成分析显示,各组 GC 含量区间为 45.04%45.64%,各样品 Q30 的碱基质量值比例均大于 92%(表 3),表明转录组测序数据质量高,可以用于后续分析。长吻 FG 和 SG 组脑组织的转录组测序结果已提交至 NCBI 的 SRA 数据库(PRJNA833735)。2.3 差异表达基因统计及表达模式分析 基于表达量指标 FPKM,以 P1 为阈值,对同一基因在 FG 组和 SG 组中的表达进行统计分析。与 SG 组相比,F
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