抗菌肽Hepcidin诱导草鱼肾细胞miRNA表达分析.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0038抗菌肽Hepcidin诱导草鱼肾细胞miRNA表达分析岳小真 常娇娇 常新月 李槿年(安徽农业大学动物科技学院,安徽省兽医病理生物学与疫病防控重点实验室,合肥 230036)摘要:为探讨草鱼抗菌肽Hepcidin(CiHep)过表达前后草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)miRNA表达谱变化及其分子机制,将构建的重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep转染CIK细胞,通过检测CiHep基因转录水平及融合蛋白mCherry-CiHep荧光强度,筛选其最佳过表达时间。在最佳过表达时间点收集CI
2、K细胞样本,进一步利用高通量测序和qPCR技术对差异表达miRNA表达谱进行分析。结果显示,CiHep基因在CIK细胞中最佳过表达时间为转染后72h。从构建的2个sRNA文库中分别鉴定到1850与2013种已知miRNAs,并发现1266与1347种新miRNAs。与对照组相比,过表达组共筛选到460个DEmiRNAs,其中392个显著上调,68个显著下调。对5150个DEmiRNA靶基因进行GO注释和KEGG通路分析,发现436个靶基因得到GO注释,主要参与细胞进程、生物学调节和单细胞生物进程等生物学过程;157个靶基因富集于54条KEGG通路。miRNA-mRNA-免疫互作网络分析显示,2
3、9条DEmiRNA和23个靶基因潜在介导CiHep参与C型凝集素受体、PI3K-Akt、NOD样受体等13个免疫相关信号通路。12个DEmiRNAs的qPCR验证结果与高通量测序结果一致。研究解析了CiHep过表达前后CIK细胞miRNA差异表达谱特征,明晰pma-miR-199b-5p、dre-miR-15a-5p、novel_miR_317和novel_miR_536在免疫调控网络中发挥重要作用,为深入探究鱼类抗菌肽诱导miRNA免疫调节的分子机制奠定了基础。关键词:铁调素;过表达;草鱼肾细胞系;miRNA;差异表达谱中图分类号:S942.1 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(
4、2023)11-1827-11 Hepcidin(Hepatic bactericidal proteins)又称铁调素,是一类富含半胱氨酸,兼有广谱抗菌、免疫调节和铁代谢调节作用的抗菌肽1。自Shike等2从杂交条纹鲈(Morone chrysops)中分离到Hepcidin以来,国内外学者对鱼源抗菌肽Hepcidin的抗菌活性进行了广泛研究。研究结果表明该抗菌肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、副溶血弧菌(Vi-brio parahaemolyticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobac-ter baumannii)和海豚链球菌(Streptococcus i
5、niae)等多种水产生物病原菌均具有较强的体外抑菌活性3,4。同时发现,注射或饲投该抗菌肽可通过调节宿主免疫功能而发挥体内抗迟缓爱德华氏菌(Edwardsie-lla tarda)或柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)作用5,6。因此,鱼源Hepcidin被认为是最有前景的新型抗菌感染药物之一。但是,目前关于鱼源Hep-cidin的抗菌作用机制和免疫调节机制尚不完全清楚,这限制了其开发应用。微小核糖核酸(miRNA)是由内源性基因编码的长度在1825 nt的单链非编码小分子 RNA7。在脊椎动物中,miRNA能够通过与靶基因mRNA的3端非翻译区互补结合,引起靶标mR
6、NA降解或翻译抑制,从而在转录后水平调控基因表达,并参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫等诸多生物学过程8。已有研究报道,鱼类miRNA可以通过靶向免疫信号通路中的多个分子调控先天免疫应答,从而在宿主受病原菌感染及疫苗诱导的免疫应答中发挥着重要作用。如在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中,miR-146a通过靶向负调控TRAF6表达促进石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)的复制9。Huo等10研究表明,鲫(Carassius auratus)鳃中miR-17、miR-26a、第 47 卷 第 11 期水 生 生 物 学 报Vol.47,No.11 2023 年 11 月ACTA H
7、YDROBIOLOGICA SINICAN o v.,2 0 2 3 收稿日期:2023-02-05;修订日期:2023-03-20基金项目:安徽省高等学校自然科学研究项目(YJS20210204)资助 Supported by the Natural Science Foundation of Anhui Province ofChina(YJS20210204)作者简介:岳小真(1998),女,硕士研究生;主要从事鱼类病原微生物与免疫学研究。E-mail:通信作者:李槿年(1962),主要从事鱼类病原微生物与免疫学研究。E-mail:miR-144和miR-146a等关键miRNAs在嗜水
8、气单胞菌感染后的局部免疫反应中发挥了关键作用。曹守林11研究发现加州鲈(Carassius auratus)免疫接种鰤鱼诺卡氏菌双载体核酸疫苗后,脾脏中显著下调的ola-miR-139靶向TRAF6激活NF-B通路,从而增强疫苗诱导的免疫应答水平。然而,迄今为止鱼源抗菌肽Hepcidin过表达能否诱导细胞miRNA表达谱变化,以及细胞中关键miRNA在Hepcidin免疫调节机制中的作用尚未见报道。我们在前期研究中已证实草鱼Hepcidin(CiHep)具有良好的体外抗拟态弧菌活性12,且体内注射的CiHep基因重组真核表达质粒可通过调节机体免疫功能而保护65%草鱼抗拟态弧菌感染(结果未发表)
9、,但其免疫调节机制尚不明确。为此,本研究借助高通量测序和生物信息学软件分析CiHep过表达前后CIK细胞中miRNA差异表达谱,挖掘富集在免疫信号通路中的关键差异表达miRNA及其靶基因,以期为从miRNA角度深入研究抗菌肽CiHep的免疫调节机制打下基础。1 1 材料与方法 1.11.1 实验材料草鱼肾细胞系由本实验室保存;大肠埃希氏菌DH5菌株(Escherichia coli DH5)感受态细胞购于北京擎科新业生物技术有限公司;真核表达载体pmCherry-N1由上海兽医研究所刘光清研究团队惠赠。1.21.2 CiHep基因的重组表达质粒构建根据草鱼Hepcidin(CiHep)基因成熟
10、肽序列(NO.JQ246442.1)设计1对带有酶切位点的特异性引物(表 1),用于构建重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep。以CIK细胞cDNA为模板,PCR扩增CiHep基因。PCR反应体系(50 L)为:2Taq PCR MasterMix 25 L,上、下游引物各1 L,DNA模板2 L,ddH2O 21 L。PCR反应条件为:95预变性5min;95变性30s,65退火30s,72延伸30s,30个循环;72 3min。将纯化的PCR产物与空载体pmCherry-N1依次进行Xho 与EcoR 双酶切、酶连及转化E.coli DH5感受态细胞。取转化液均匀涂布于含100 g
11、/mL Kana的LB培养基,37培养16h。随机挑取3个菌落进行扩大培养后,抽提重组质粒进行PCR与双酶切鉴定。1.31.3 CiHep基因最佳过表达时间的筛选为了以转染后CiHep基因相对表达量及其蛋白表达量达到最大值的CIK细胞作为测序样品,需要筛选CiHep基因的最佳过表达时间点。首先将生长状态良好且密度为2106个/孔的CIK细胞接种至表 1 本研究所用引物的序列信息Tab.1 Primer and sequence used in this study引物Primer序列Sequence(53)用途Application来源SourcepmCherry-N1-Cihep-FCCGC
12、TCGAGATGCAAAGCCATCTTTCCCTGTGConstraction of pmCherry-N1-CiHep本实验pmCherry-N1-Cihep-RCGGAATTCCGGAGAATTTACAGCAATATCCACAGCihep-qPCR-FCCGGAATTCATGCAAAGCCATCTTTCCCTGTGCART-qPCR12Cihep-qPCR-RCCGCTCGAGTCAGAATTTACAGCAATATCCACAGRT-qPCR12-actin-FTCTGCTATGTGGCTCTTGRT-qPCR12-actin-RACCTGAACCTCTCATTGCTTRT-qPCR12a
13、bu-miR-24a-FTGGCTCAGTTCAGCAGGAACRT-qPCR本实验dre-miR-34c-5p-FCAGGCAGTGCAGTTAGTTGATTACRT-qPCR本实验pma-miR-199b-5p-FCCCAGTGTTCTGACTACCTGTTCRT-qPCR本实验ipu-miR-24-FTGGCTCAGTTCAGCAGGAACART-qPCR本实验mze-miR-187-FGTCGTGTCTTGTGTTGCAGCCAGTRT-qPCR本实验cfa-miR-99a-FCAACCCGTAGATCCGATCTTGTRT-qPCR本实验abu-miR-192-FGCATGACCTA
14、TGAATTGACAGCCRT-qPCR本实验dre-miR-19c-3p-FTGTGCAAATCCATGCAAAACTCRT-qPCR本实验dre-miR-221-5p-FACCTGGCATACAATGTAGATTTCTGTRT-qPCR本实验dre-miR-301a-FGCCAGTGCAATAGTATTGTCAAAGRT-qPCR本实验bv-miR-181b-5p-FACATTCATTGCTGTCGGTGGRT-qPCR本实验ccr-miR-140-5p-FGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGRT-qPCR本实验miR U6-FCGCTTCGGCAGCACATATACRT-qP
15、CR13miR U6-RTTCACGAATTTGCGTGTCART-qPCR13注:下划线部分为酶切位点序列Note:The underlined part is the sequence of enzyme digestion sites1828水 生 生 物 学 报47 卷6孔细胞培养板,用MEM完全培养液于28、5%CO2条件下培养至80%汇合度,弃去孔内培养液,更换为不含血清与双抗的细胞培养液,使用Lipofecta-mine 3000脂质体转染试剂将重组表达质粒pmChe-rry-N1-Cihep转染至细胞中,转染后每一检测时间点(48h、72h和96h)做6个复孔(用于检测基因转录
16、与蛋白表达各3孔)。转染体系为:2.5 g质粒、3.75 L转染试剂和250 L不含血清与双抗的细胞培养液。分别于转染后不同时间点(48h、72h和96h)收集细胞样品,用TRIzol试剂提取细胞总RNA,按照FastKing RT Kit(With gDNase)反转录试剂盒说明书合成cDNA作为实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR,qPCR)检测用模板。根据CiHep基因序列设计用于荧光定量PCR(RT-qPCR)检测的特异性引物,并选用-actin作为内参基因(表 1)。qPCR反应体系:2SuperReal PreMix Plus 10 L,cDNA模
17、板100 ng,上下游引物各0.5 L,RNase free ddH2O补足至20 L。反应条件:95 预变性15min、9510s,60 30s,共计40个循环,每个样品做3个技术重复。在反应结束后,使用2Ct法14计算各检测时间点(转染后48h、72h和96h)目的基因相对转录水平,并进行单因素方差分析。进一步,分别于转染后不同时间点(48h、72h和96h),弃去细胞孔内培养液,磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次,用4%多聚甲醛室温固定细胞15min,PBS洗涤3次,再用DAPI染核10min,PBS洗涤3次,在荧光倒置显微镜下观察荧光融合蛋白mCherry-CiHep的表达情况。1.41
18、.4 测序样品采集与细胞总RNA提取按1.3方法将重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep转染CIK细胞,共转染3个孔(转染组),同时做3孔PBS对照(PBS对照组)。转染后72h,收集各孔细胞,用TRIzol Reagent提取细胞总RNA。然后,利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer(ThermoScientific)测定总RNA浓度与纯度,使用AgilentBioanalyzer2100(Agilent Technologies)评估RNA完整性(RIN)。若A260/A280 1.8且RIN 7,表明RNA质量合格。1.51.5 sRNA文库构建
19、与miRNA测序将质检合格的二组各3个RNA样品等量混合为2个测序样品(编号TRH与TRQ)送至北京百迈客生物科技有限公司进行miRNA测序。即PAGE电泳切胶得到大小为1830 nt目的片段,通过单链DNA接头连接,加入消化酶去除3接头,以带UMI的RT引物进行反转录延伸,合成cDNA;高敏聚合酶扩增富集cDNA,再进行文库定量和pooling环化,构建sRNA文库后,利用Illumina HiSeq 2500 测序平台进行高通量测序,测序读长为测序读长为single-end(SE)50 nt。1.61.6 miRNA的鉴定与预测测序得到的原始数据为图像文件经过base call-ing,得
20、到以fastq格式存储的raw reads。利用FastQC软件15去除raw reads中带有接头与低质量序列,统计序列的总数、种类及长度,得到纯净序列clean reads用于生物信息学分析。运用Bowtie软件16将长度为1830 nt的CleanReads比对至草鱼参考基因组(http:/ miRNA)rRNAtRNAsnRNAsnoRNArepeatgene新miRNA(No-vel miRNA)顺序对每个sRNA进行注释,获得过表达CiHep前后CIK细胞的miRNA表达谱。再将有效reads与miRBase 22.0数据库中miRNA前体与成熟肽序列进行比对,完全匹配的序列认定为
21、knownmiRNA。对于未注释的序列,则依据miRNA前体的发夹结构、二级结构和最低自由能等信息,运用miRDeep2软件17预测novel miRNA。1.71.7 差异表达miRNA筛选及其靶基因功能分析计算测序样品中miRNA的表达量,使用TPM(每百万次读取的转录本)进行归一化处理。以|log2(Fold change)|0.585,且FDR(错误发现率)0.05为筛选标准,利用edgeR软件18筛选抗菌肽过表达前后CIK细胞中显著差异表达的miRNA(DEmiRNA)。为挖掘miRNA的下游靶基因,联合利用Tar-getScan和miRanda软件19对DEmiRNA进行靶基因预测
22、,取两者的交集作为潜在靶基因。进而用基因本体论数据库(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)对潜在靶基因进行功能注释和通路富集分析。为了进一步分析DEmiRNA可能在调控网络中发挥的作用,运用在线分析软件Cytoscape(http:/www.cytoscape.org/)20绘制与免疫过程相关的miRNA-mRNA-免疫调控网络互作图。1.81.8 差异表达miRNA的qPCR验证为了验证筛选的差异表达miRNA的准确性,随机取12个已知DEmiRNA(7个下调、5个上调)进
23、行PolyA加尾法qPCR检测。即先委托北京擎科生物科技有限公司设计与合成miRNA上游引物,下游引物则为miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒中提供的通用引物。进而用该试剂盒将测序生物公司返回的RNA样品反转录为cDNA,并以此为模板,11 期岳小真等:抗菌肽Hepcidin诱导草鱼肾细胞miRNA表达分析1829按照1.3方法中体系与反应条件进行qPCR检测,U6作为内参基因。反应结束后采用2Ct法计算miRNA相对表达量。1.91.9 数据分析所有的qPCR检测结果均用均数标准差(meanSD)表示。利用SPSS 26.0软件中的单因素方差(One-Way ANOVA)法分析miR
24、NA和mRNA表达量在对照组与过表达组中的差异水平(P0.05,差异显著;P0.01,差异极显著;P0.001,差异极极显著),并采用Graphpad Prism 8作图。2 2 结果 2.12.1 重组表达质粒的PCR与双酶切鉴定采用常规酶切酶连法构建重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep,抽提质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果如图 1所示,以质粒DNA为模板扩增到目的基因CiHep(图 1a泳道,99 bp);双酶切反应后均获得两条DNA条带,其大小分别与空载体和目的基因大小基本一致(图 1b泳道3和4),说明重组表达质粒pmCherry-N1-Cihep构建成功。2.22.2 Ci
25、Hep基因的最佳过表达时间通过检测瞬时转染后不同时间点CiHep基因转录情况(mRNA表达水平)及其荧光融合蛋白表达情况,综合分析其最佳过表达时间。结果如图 2所示,与未转染的细胞对照组相比,转染组CiHep基因mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调(P0.01),且转染后72h的mRNA表达水平极显著高于48h(P0.01)和极极显著高于96h(P0.001)。荧光倒置显微镜观察到各检测时间点红色荧光融合蛋白mChe-rry-CiHep在胞质与胞核中均有表达,且以转染后72h细胞发出的红色荧光强度最高(图 3)。结果说明CiHep基因在CIK细胞中最佳过表达时间为转染后72h,应选择该时间
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