聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌LBX-2烷烃羟化酶基因SaalkB的克隆与表达分析.pdf
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1、书 书 书 年月第卷第期四川师范大学学报(自然科学版)(),收稿日期:接受日期:基金项目:国家自然科学基金青年基金()通信作者简介:邵欢欢(),男,副教授,主要从事环境微生物与基因工程的研究,:引用格式:张榕麟,高田蕊,陈美菊,等聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析四川师范大学学报(自然科学版),():聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基因的克隆与表达分析张榕麟,高田蕊,陈美菊,熊爽,何欣怡,雍彬,邵欢欢(四川师范大学生命科学学院,四川成都)摘要:白浅灰链霉菌()能够高效降解聚乙烯(,),而烷烃羟化酶基因在聚乙烯降解中可能发挥重要作用以基因组为模板,利用技术扩增基因,该基因全
2、长 ,编码个氨基酸对该基因编码蛋白进行生物信息学分析,发现蛋白包含个跨膜结构域,无信号肽,属于亲水性蛋白,二级结构主要由无规则卷曲和螺旋组成,与链霉菌 的蛋白的同源性达将克隆得到的基因连接到表达载体上进行原核表达,且重组工程菌株能够降解 结果显示得到与预期蛋白分子量()大小一致的蛋白利用荧光定量发现,白浅灰链霉菌在以为唯一碳源的培养基中基因的表达量约为在高氏一号培养基中的倍;蛋白质组学数据分析发现,白浅灰链霉菌在以为唯一碳源培养 和 时,蛋白的表达量比在高氏一号培养基中分别上调了 和 倍,表明基因可能是白浅灰链霉菌降解聚乙烯的关键基因关键词:白浅灰链霉菌;基因克隆;表达分析中图分类号:文献标志
3、码:文章编号:():塑料因其具有强度大、重量轻、柔韧性好、易于生产和成本低廉等特点,被广泛应用于人类生活、工业生产等各个领域据相关文献报道,全球塑料年产量约为亿,其中聚乙烯(,)约占,是塑料生产的重要组成部分然而废弃塑料造成的环境污染问题日益严重,随着时间推移,的塑料被风化分解为直径小于 的微塑料,广泛分布于全球各地,对河流、湖泊、耕地等造成严重污染,且在海洋、淡水、土壤、陆地生物体内均发现了微塑料的存在,严重危害生物体健康 分子排列紧密、疏水性强、表面能低且化学性质稳定,因此在自然界中很难被降解,导致废弃物在环境中大量积累,如何彻底降解废弃物已经成为一个全球性难题生物降解是一种绿色环保、低能
4、耗的降解方式通过微生物降解将其无机矿化为和,该降解方式极有可能成为减少“白色污染”的有效途径之一生物降解的第一步是氧化,由微生物产生胞外酶氧化长烃链断裂研究发现烷烃羟化酶、漆酶以及过氧化物酶等多种酶类具有氧化降解的能力 等发现过氧化物酶可以显著提高高密度聚乙烯薄膜的亲水性 等发现赤红球菌分泌的漆酶可降低低密度聚乙烯的分子量及增加酮羰基指数,认为可由漆酶催化打断聚乙烯长链烷烃单加氧酶(,)是烷烃羟化酶(,)系统的催化组分,参与烃类代谢途径的第一步,通过末端或次末端氧化降解烃类低聚物烷烃羟化酶系统包含个组份,分别是个非血红素铁的膜整合的单加氧酶(第期张榕麟,等:聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌烷烃羟化酶基
5、因的克隆与表达分析,)和个电子转移蛋白红素氧还蛋白(,)、红素氧还蛋白还原酶(,)等通过实时荧光定量检测烷烃羟化酶基因表达量,以监测聚乙烯降解菌的丰度 等将降解细菌铜绿假单胞菌的烷烃羟化酶基因在大肠杆菌中表达,经 堆肥生物降解将低分子量近的碳矿化为,认为基因在低分子量降解过程中发挥重要作用 等克隆了降解细菌铜绿假单胞菌的烷烃羟化酶基因并在大肠杆菌中表达,发现在含有低密度的培养基中转录水平增加了倍,重组菌株表现出对的高生物降解能力,而不含的菌株对完全无降解作用,证实了是降解聚乙烯不可或缺的基因本实验室前期从土壤中分离筛选得到一株能够降解聚乙烯的放线菌 白浅灰链霉菌,该菌株对淀粉聚乙烯降解 的失重
6、率可达 蛋白质组与代谢组数据表明基因可能在白浅灰链霉菌降解的过程中发挥重要作用因此,本研究通过克隆白浅灰链霉菌烷烃单加氧酶基因,对基因片段进行测序及序列同源性分析,并对其编码蛋白氨基酸序列、理化性质、信号肽等进行生物信息学分析构建基因的原核表达载体并进行重组蛋白的原核表达,通过分析重组工程菌株对膜片的降解效果;通过荧光定量分析基因在聚乙烯降解过程中的表达情况;通过蛋白组数据分析蛋白在聚乙烯降解过程中的表达情况本研究可为深入探索基因在聚乙烯降解过程中的作用提供理论依据,也为研究白浅灰链霉菌降解聚乙烯的过程及机制提供思路材料和方法 实验材料白浅灰链霉菌由本实验室分离并保存 感受态、()感受态与原核
7、表达载体 、凝胶回收试剂盒均购自成都擎科梓熙生物技术有限公司质粒提取试剂盒购自公司细菌基因组提取试剂盒、以及 购自天根生化科技(北京)有限公司 和卡那霉素购自公司、购自公司 反转录试剂盒购自 粉末()购自中国石油化工股份公司茂名分公司 膜片购自海门市扬子医疗器械有限公司引物根据基因序列与序列设计,由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成(见表)表引物序列 序号引物序列()培养基高氏一号培养基():可溶性淀粉(用于蛋白质组学分析时为),值 以为唯一碳源的无机盐培养基():,值 每 培养基内加入经紫外灭菌处理的粉末 或膜片()白浅灰链霉菌总和提取采用细菌基因组试剂盒制备白浅灰链霉菌总由于白浅灰链霉菌是革
8、兰氏阳性菌,且在液体培养基中呈球状,较难破壁,故先将菌体混合石英砂在液氮中研磨,再按照试剂盒提供的操作步骤提取基因组白浅灰链霉菌总利用法提取,并利用凝胶电泳对其纯度和完整性进行检测;同时使用反转录试剂盒进行反转录得到该菌株的总 白浅灰链霉菌 基因扩增及测序以白浅灰链霉菌总为模板,和为扩增引物,扩增基因 反应体系为:基因组 ,四川师范大学学报(自然科学版)第卷(),(),(),(),补足至 扩增条件为:预变性,进入循环;变性;退火;延伸;循环次;延伸 使用纯化回收试剂盒回收目的片段,取 目的,依次加入 ,混匀后 反应,连接产物转化 感受态细胞,取 转化液涂布于含有 卡那霉素的固体培养基中,过夜培
9、养,挑取单菌落接种至含 卡那霉素的液体培养基中,、振荡培养 ,提取质粒进行验证经鉴定为阳性的菌株,送往成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序,对测序正确的菌株进行菌种保藏 生物信息学分析将克隆得到的基因序列进行(:)相似性比对分析;蛋白的理化性质使用(:)在线分析;应用 (:)进行蛋白信号肽预测;使用(:?)在线预测蛋白二级结构;使用(:)在线预测蛋白三级结构;运用(:)预测蛋白的跨膜结构;应用中的程序对蛋白进行序列同源性分析,利用软件 比对序列,采用近邻相接法()构建系统进化树,氨基酸的进化距离使用模型 重组蛋白的诱导表达将测序验证正确的重组质粒转入 ()中,使用含有卡那霉素()的平板进行筛选
10、,过夜培养,挑取单菌落至含 卡那霉素的液体培养基中,、振荡培养至为 时,加入 ,低温诱导表达 取 菌液超声破碎 次至透明,离心取菌体沉淀,加入 上样缓冲液后取样进行凝胶电泳 重组菌株处理膜片使用以膜片为唯一碳源的无机盐培养基培养上述构建的重组工程菌株,以空载体 ()作为对照组,每组设个重复培养 后,从对照组和实验组的摇瓶中分别回收膜片,用蒸馏水清洗膜片数次,再将膜片放入终质量分数为的溶液中,超声清洗 后置于 环境中过夜,然后依次用无水乙醇、清洗,干燥后用原子力显微镜(,)在 的扫描速度下观察膜片表面形貌 荧光定量以白浅灰链霉菌总为模板,和为引物,采用染料法对基因进行相对荧光定量检测反应体系为:
11、(),(),(),补足至 反应条件:预变性,进入循环;变性;退火;延伸;循环次,保温,重复次数 从 到 进行溶解曲线分析,去除引物二聚体和其他非特异性扩增利用 分析数据,定量方法为法 蛋白的表达量分析分别使用以粉末为唯一碳源的无机盐培养基和高氏一号培养基培养白浅灰链霉菌,每组设个重复,、振荡培养在培养至(指数生长期)和(平台期)时进行取样,取菌液于 、条件下离心,收集全部菌体,以粉末为唯一碳源培养 和 的样品分别标记为、,用高氏一号培养基培养 和 的样品分别标记为、对样品进行蛋白质测序并获得蛋白质组学数据,通过序列比对和信息注释找到蛋白,利用软件制作热图分析其表达量,并比较不同碳源、不同时间组
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