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金黄色葡萄球菌致新西兰兔脓胸生物被膜模型的建立.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金资助项目(:)广西自然科学基金面上资助项目(:)通信作者:王可:.广西南宁市双拥路 号金黄色葡萄球菌致新西兰兔脓胸生物被膜模型的建立张文淑 唐秀家 叶柳镅 王可广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科广西南宁 摘要 目的:建立金黄色葡萄球菌感染的新西兰兔脓胸模型观察其胸腔内是否有生物被膜形成 方法:选取 只健康雄性新西兰兔按随机数字表法分为实验组和对照组各 只 通过胸腔穿刺术于右侧第六肋间隙将导管置入胸腔实验组注射剂量为 /的/金黄色葡萄球菌对照组使用相同剂量的 ()肉汤 建模后持续饲养并于第 天收集胸腔留置导管进行活菌计数和结晶紫染色 收集所有脓性絮状物的匀浆液和
2、洗涤液用于菌落计数 切取壁层胸膜组织进行苏木精伊红()染色观察胸膜病理改变情况肽核酸荧光原位杂交()用于观察脓性絮状物中的生物被膜形成 结果:与对照组比较实验组患侧胸腔有脓性絮状物形成和胸膜粘连 实验组导管菌落计数显著大于对照组(.)结晶紫染色 值显著高于对照组(.)通过计算匀浆液和洗涤液的 验证了实验组胸腔内积聚了大量金黄色葡萄球菌 染色结果显示实验组胸膜明显增厚并伴随有大量炎症细胞浸润 结果证实实验组兔子胸腔脓性絮状物中有生物被膜形成 结论:金黄色葡萄球菌致新西兰兔脓胸感染模型中胸膜腔内存在生物被膜 关键词 金黄色葡萄球菌 脓胸 导管 生物被膜中图分类号.文献标识码 ./.:.:.:.(/
3、)/().().().:.(.).:.内科急危重症杂志 年 第 卷 第 期 脓胸是指病原菌进入到胸膜腔出现化脓性渗出物积聚于胸膜腔内 脓胸的主要致病菌为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和假单胞菌属菌等其中金黄色葡萄球菌是最常见的感染微生物 非常容易黏附于导管(如静脉导管、气管插管等)及植入设备(如起搏器、心脏瓣膜等)表层并产生生物被膜 金黄色葡萄球菌感染后胸膜腔内生物被膜形成及其对药物产生抵抗是该类疾病预后差的最为关键的因素之一生物被膜是指由微生物细胞自身产生的胞外基质聚合物包裹的三维立体结构除了细菌自身所释放的基质之外源自于宿主的相关成分如纤维蛋白等也可以融合于生物被膜之中共同保护细菌抵抗各类抗菌
4、药治疗减少机体免疫应答反应以及吞噬效应 本研究通过建立兔金黄色葡萄球菌感染脓胸模型观察验证金黄色葡萄球菌感染致脓胸胸腔内是否有生物被膜形成材料与方法 实验动物 清洁级健康雄性新西兰兔 只体重(.)购于广西医科大学实验动物中心实验动物使用许可证号:桂 生产许可证号:桂 饲养于独立的兔笼中自由饮食环境温度()相对湿度正常大气流动 实验方案经过医院伦理委员会审核伦理审批号:.()主要仪器和试剂 超净台(苏州净化)双功能气浴恒温振荡器(常州金坛良友)紫外分光光度计()生物安全柜(苏净安泰)多功能酶标仪()快速混匀器(江苏新康)生化培养箱(恒 宇)常 温 离 心 机(德 国 赫 默)超低温冰箱()一次性
5、输液用 号头皮针管(岳阳民康)琼脂粉、肉汤(北京陆桥)戊巴比妥钠()苏木精 伊红()染色试剂盒(索莱宝)试剂盒(美国)磷酸缓冲盐溶液()(索莱宝.)一次性接种环(湖南比克曼)一次性涂布棒、细菌培养皿(广州洁特)菌液的制备 本实验所用菌株为金黄色葡萄球菌(购自上海康朗生物货号:)加入 甘油的 培养基中 存储备用生物安全柜紫外照射 后使用一次性接种环刮取适量菌体接种到 培养皿置于 培养 之后挑取单个菌落在 转/气浴恒温振荡器中连续增殖 常温转/离心 弃上清 洗涤 次 使用紫外分光光度计进行调菌参数定为 .(菌量是/)使用 肉汤稀释为/最终经菌落计数法确认细菌浓度新西兰兔脓胸模型的建立将 只兔子按照
6、随机数字表法分成对照组和实验组各 只 经耳缘静脉缓慢注射 戊巴比妥钠进行麻醉固定在手术台上剃毛备皮定位第 肋间(距脊柱 )为穿刺点 碘伏消毒铺巾沿穿刺点做一长约 切口直镊辅助导管(号头皮针管岳阳民康)进行胸腔穿刺检查导管是否位于胸腔中 注射器插入导管末端进行回抽排出穿刺过程中可能进入胸腔的气体 依据 /用量经导管注入剂量为/的上述菌液至实验组兔子右侧胸腔内随后注入 溶液冲洗导管 将 长导管全部送至胸腔内后进行穿刺切口缝合 缓慢晃动兔子使菌液均匀分布在胸腔内待兔子苏醒后送回兔笼继续饲养 对照组则于右侧胸腔中注入相同剂量的 肉汤其它的操作和实验组相同胸膜粘连评分建模后第 天经耳缘静脉注射过量戊巴比
7、妥钠麻醉处死兔子胸壁常规消毒铺巾后使用高压灭菌手术器械开胸拍照记录兔子胸腔大体观 通过胸腔积液量和胸膜粘连评分来评估脓胸的严重程度实验结果由 名不知实验设计分组的实验员进行评分 按照脓胸评分量表(分):正常胸腔 黏液稀薄的脏、壁层胸膜 胸膜剥脱很少只有少量脓性渗出液 中度胸膜剥脱伴脓性渗出物 大量脓性渗出物留置导管分析取出留置导管清除表面絮状物生理盐水冲洗导管内外表面 切取一半导管置入盛有 生理盐水的洁净离心管中使用快速混匀器震荡 后超声清洗 随后将该溶液稀释后均匀涂盘培养 后进行活菌计数收集另一半导管进行结晶紫染色导管洗涤 次后对半剪开到 孔板中用.结晶紫染色 冲洗 次 待导管干燥后用 冰醋
8、酸脱色 通过酶标仪检测 处 值肽核酸荧光原位杂交()将脓性絮状物收集在盛有 溶液的试管中 洗涤 次后匀浆机匀浆 收集洗涤液和匀浆液用于菌落计数 将匀浆置于载玻片上并用火焰固定在暗视野中滴加 金黄色葡萄球菌特异性 内科急危重症杂志 年 第 卷 第 期注:红色箭头指向粘连条带蓝色箭头指向脓性絮状物图 新西兰兔脓胸大体观注:与对照组比较.、.图 留置导管的菌落计数和结晶紫染色结果注:与对照组比较.图 脓性絮状物洗涤液和匀浆液的菌落计数结果图 脓性絮状物 分析()探针于玻片上进行杂交盖上盖玻片后封胶置于避光湿盒中孵育 在黑暗环境下去除胶水和盖玻片将载玻片浸入已预热至 的洗涤液中 载玻片自然干燥后加入
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