基于RORγt_FoxP3免疫失衡探讨定喘汤对呼吸道合胞病毒诱导肺炎性损伤幼鼠免疫微环境的影响.pdf
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1、基于/免疫失衡探讨定喘汤对呼吸道合胞病毒诱导肺炎性损伤幼鼠免疫微环境的影响张秀英瞿圣岳王雪峰王 蕾赵航宇(.辽宁中医药大学附属医院辽宁 沈阳.辽宁中医药大学研究生院辽宁沈阳)摘要 目目的的 研究定喘汤对呼吸道合胞病毒()诱导肺炎性损伤幼鼠转录因子孤核受体()、叉头翼状螺旋转录因子()及其相关细胞因子表达的影响揭示定喘汤治疗 诱导肺炎性损伤的作用机制 方方法法 将 只幼龄 大鼠随机分为正常组、模型组、定喘汤组每组 只 模型组、定喘汤组采用 滴鼻法建立肺炎性损伤模型 定喘汤组在第 天滴鼻 后给予定喘汤 /()灌胃 次/连续 实验第 天取肺组织观察肺损伤情况计算肺湿干比 和 法检测肺组织中、和蛋白表
2、达情况法检测肺泡灌洗液中转化生长因子()、白细胞介素()、白细胞介素()、白细胞介素()含量 结结果果 模型组幼鼠肺泡壁受损肺间质大量炎性细胞浸润定喘汤组幼鼠肺泡壁损伤和肺间质炎性细胞浸润较模型组轻 与正常组比较模型组肺组织病理损伤评分、湿干比、肺组织中 及蛋白相对表达量和肺泡灌洗液中 、含量均明显增高(均.)肺组织中 及蛋白相对表达量和肺泡灌洗液中、含量均明显降低(均.)与模型组比较定喘汤组肺组织病理损伤评分、湿干比、肺组织中 及蛋白相对表达量和肺泡灌洗液中 、含量均明显降低(均.)肺组织中 及蛋白相对表达量和肺泡灌洗液中 、含量均明显升高(均 )结结论论 诱导肺炎性损伤时/及相关细胞因子表
3、达异常定喘汤可通过调控/及相关细胞因子表达调节免疫微环境减轻 诱导肺炎性损伤关键词 定喘汤呼吸道合胞病毒转录因子孤核受体叉头翼状螺旋转录因子肺炎性损伤:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 张秀英女博士副主任医师硕士研究生导师研究方向为中医药防治儿童常见病基金项目 国家自然科学基金项目()基于重点研究室研究领域的中医药多学科研究能力提升项目()/(.):()()()./().现代中西医结合杂志 ()()()()().(.)(.).(.)(.)././.:呼吸道合胞病毒()是婴儿急性呼吸道感染的一个重要和常见原因也是婴儿住院的主要原因 几乎所有儿童在 岁时都感染过 感染引起肺部炎
4、性损伤可导致咳嗽、喘息或毛细支气管炎严重 诱导肺部炎性损伤可致坏死和上皮细胞脱落进入气道气道黏液、水肿和细支气管周围炎症累积可导致气道阻塞 诱导的肺部炎性损伤目前西医无特效治疗药物 临床研究显示定喘汤能明显缩短毛细支气管炎患儿病程缩短肺部体征消失时间基础研究也显示定喘汤能降低 诱导肺部炎性损伤时肺组织的病毒载量减轻肺组织损伤程度但其机制尚不清晰因此本研究以转录因子孤核受体()/叉头翼状螺旋转录因子()免疫微环境失衡为切入点通过观察 诱导幼鼠肺炎性损伤时肺组织/基因和蛋白、肺泡灌洗液中抑炎因子和促炎因子的变化探讨定喘汤对 诱导幼鼠肺炎性损伤免疫微环境的调节作用阐明其作用机制 实验材料与方法 病毒
5、 株来源于首都儿科研究所冻存于辽宁中医药大学附属医院病毒室半数组织培养感染量为 实验动物 周龄雄性 大鼠 只体重 购于辽宁长生生物有限公司合格证号(许可证号):(辽)幼鼠置于无病原体清洁笼内饲养保持室温()饲料和饮用水经高温高压消毒每日自由饮食 本研究符合实验动物保护各项要求已获得辽宁中医药大学动物伦理委员会的批准()实验药物定喘汤由麻黄、杏仁、半夏、苏子 、黄芩 、桑白皮 、白果 、款冬花、甘草 组成药物均购自辽宁中医药大学附属医院中药局按照传统方法水煎 次混合后制成含生药 /的药液备用 试剂及仪器 超纯水系统()、超速冷冻离心机(湖南湘仪)、微量移液器(、)、真空干燥箱()、紫外分光光度计
6、()、荧光定 量 仪()、电 泳 仪(北京六一)、转移槽(北京六一)、双垂直蛋白电泳仪(北京六一)、凝胶成像系统(型北京六一)、酶标仪()、电 热 恒 温 培 养 箱(天津泰斯特)、()、()、()裂解液()、()、蛋白浓度测定试剂盒()、()()、蛋白上样缓冲液()、发 光 液()、膜()、一抗()、现代中西医结合杂志 ()一抗()、羊抗兔 ()、内参抗体()、转化生长因子 ()检测试剂盒()、白细胞介素 ()检测试剂盒()、白细胞介素()检测试剂盒()、白细胞介素()检测试剂盒()实验方法正常组给予不含病毒的生理盐水(/只)滴鼻 模型组和定喘汤组乙醚轻度麻醉并用 病毒液滴鼻感染每鼻孔 鼻孔
7、均滴共 连续 建立肺炎性损伤模型 定喘汤组在第 天滴鼻 后给予定喘汤 /()灌胃 次/连续 所有大鼠均在同一条件下喂养 检测指标及方法 实验第 天取肺组织观察肺损伤情况计算肺湿干比检测、和蛋白表达情况取肺泡灌洗液检测 和 相关细胞因子含量 肺组织病理损伤情况将肺脏浸入 多聚甲醛固定石蜡包埋后连续切片脱蜡 染色镜下观察 参照文献每张切片随机选高倍视野 个从肺泡充血、出血、血管壁中性粒细胞浸润和肺泡间隔增厚程度 个方面进行病理学评分将 项得分相加作为总分 肺湿干比 取左侧肺组织滤纸吸干血迹后称湿重然后置于 烤箱中烘烤 再称干重计算肺湿干比 肺组织中、表达情况 取肺组织采用 法提取细胞总 用 试剂盒
8、反转录合成 用 试剂盒测定组织相关基因表达情况 以总 为模板合成 进行 反应扩增条件:循环 次 每.在 扩增结束后以 表示 相对表达量 引物序列由苏州金唯智生物有限公司合成 上 游 引 物 序 列 为 下游引物序列为 引物长度为 上游引物序列为 下游引物序列为 引物长度为 肺组织中、蛋白表达情况 采用 法检测:取肺组织依次装入标好的 管放入液氮中快速冷冻加入 蛋白裂解液冰上快速剪碎组织超声破碎仪上超声 次静置 再超声 次(冰上操作功率 )置于水浴锅中 水浴 下 离心 取上清采用法测定蛋白浓度取蛋白样品 进行 分离 变性 下 离心 电泳 随后 转膜 脱 脂 奶 粉 封 闭 加 入 一 抗()、一
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