淀粉-油酸复合物构建及其理化性质研究.pdf
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1、 ,N o 收稿日期:;修回日期:作者简介:贺志姝(),女,硕士研究生,研究方向为谷物与淀粉工程.通讯作者:王韧(),男,博士,教授,博士研究生导师,研究方向为粮食精深加工工程与技术研究.d o i:/j i s s n 淀粉油酸复合物构建及其理化性质研究贺志姝,王涛,冯伟,张昊,周星,王韧,(江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心,江苏 无锡 ;江南大学食品学院,江苏 无锡 )摘要:淀粉脂肪酸复合物的制备通常采用直链淀粉作为基质,但淀粉中直链淀粉含量较少、且价格高昂,限制了淀粉脂肪酸复合物在食品工业中的广泛应用.以蜡质玉米淀粉为考察对象,通过利用生物酶法(淀粉蔗糖酶和普鲁兰酶)定向修
2、饰其分子结构,随后与油酸复合构建淀粉油酸复合物,探究支链淀粉分子结构对淀粉油酸复合物的构建及其理化性质的影响.结果表明,蜡质玉米淀粉经过淀粉蔗糖酶改性修饰后,其分支链得到显著延长,而普鲁兰酶的改性修饰则特异性地水解淀粉的分支点.晶体衍射和热特性分析显示,淀粉支链延长修饰或分支点水解均促进了V型淀粉油酸复合物的形成,V型结晶度最高可达 ,且复合物的峰值糊化温度达到 .体外消化表明,淀粉油酸复合物中的抗性淀粉含量可达 ,证明V型结晶结构具有抗酶解特性.关键词:淀粉;油酸;淀粉油酸复合物;理化性质中图分类号:S 文献标志码:A文章编号 ()P r e p a r a t i o no f s t a
3、 r c h o l e i ca c i dc o m p l e x e sa n d i n v e s t i g a t i o no f t h e i rp h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t yHEZ h i s h u,WANGT a o,F E N G W e i,Z HAN G H a o,Z HOUX i n g,WAN GR e n,(N a t i o n a lE n g i n e e r i n g R e s e a r c hC e n t e rf o rC e r e a lF e r m e n t a
4、 t i o na n dF o o dB i o m a n u f a c t u r i n g,J i a n g n a n U n i v e r s i t y,W u x i ,C h i n a;S c h o o l o fF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,J i a n g n a nU n i v e r s i t y,Wu x i ,C h i n a)A B S T R A C T:S t a r c h l i p i dc o m p l e x e sa r en o r m a l l yp r e
5、p a r e du s i n ga m y l o s ea sas u b s t r a t e H o w e v e r,al o wc o n t e n to fa m y l o s e i ns t a r c h,a sw e l l a si t sh i g hc o s t,l i m i t st h ea p p l i c a t i o no fs t a r c h l i p i dc o m p l e x e si nt h ef o o di n d u s t r y I nt h i ss t u d y,w a x yc o r ns t a
6、 r c hw a ss e l e c t e da n d i t sm o l e c u l a r s t r u c t u r ew a sd i r e c t i o n a l l ym o d i f i e db ye n z y m e s(a m y l o s u c r a s ea n dp u l l u l a n a s e),f o l l o w e db yc o m p l e x a t i o nw i t ho l e i ca c i dt op r e p a r e s t a r c h o l e i ca c i dc o m
7、p l e x e s,e x p l o r i n gt h e e f f e c t so fm o l e c u l a r s t r u c t u r eo f a m y l o p e c t i no nt h ep r e p a r a t i o na n d t h ep h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t yo f s t a r c h o l e i c a c i dc o m p l e x e s R e s u l t s s h o w e d t h a t t h eb r a n c hc h
8、 a i n so fw a x yc o r ns t a r c hw e r ee l o n g a t e db ya m y l o s u c r a s ew h i l e t h ep u l l u l a n a s es p e c i f i c a l l yh y d r o l y z e dt h eb r a n c h i n gp o i n t so fs t a r c hX R Da n dt h e r m a l s t a b i l i t ya n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h eb r
9、a n c hc h a i ne l o n g a t i o na n db r a n c h i n gp o i n t sh y d r o l y s i sf a c i l i t a t e dt h ef o r m a t i o no fV t y p es t a r c h o l e i ca c i dc o m p l e x e s,a n dt h eV t y p ec r y s t a l l i n i t ya n dp e a kg e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r ew e r e
10、a n d ,r e s p e c t i v e l y I nv i t r od i g e s t i o na n a l y s i s i m p l i e dt h a t t h ec o n t e n t o f r e s i s t a n t c o m p o n e n t r e a c h e d ,w h i c h i n d i c a t e dt h a t t h eV t y p ec r y s t a l l i n es t r u c t u r ew a sr e s i s t a n t t oa m y l o l y t
11、i ch y d r o l y s i s K E YWO R D S:s t a r c h;o l e i ca c i d;s t a r c h o l e i ca c i dc o m p l e x e s;p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t y不饱和脂肪酸作为人体必不可少的营养素,主要存在于坚果以及深海鱼类等食物中,对维持人体健康起着重要的作用.以单不饱和脂肪酸 油酸为例,它在自然界中含量丰富,具有控制体重、缓解血管硬化以及改善炎症等诸多益处.但由于分子中存在不饱和双键,使得油酸在高温、光照等环境下易被氧化,从而导致产品的风
12、味、营养价值等有所下降,进而造成食品安全风险.淀粉是自然界中最丰富的天然高分子之一,也是人体能量的主要来源,通常由直链淀粉与支链淀粉构成,其中直链淀粉的含量与植物来源以及品种相关.直链淀粉分子的线性构造可形成单螺旋结构,其疏水性空腔能够包覆碘、脂类、芳香物质等小分子.同时,淀粉与脂肪酸形成的复合物被认为是一种新型抗性淀粉,因此可作为膳食纤维具有调节肠道健康的作用.此外,淀粉与不饱和脂肪酸的复合可以保护不饱和脂肪酸分子避免或减少氧化酸败,进而提高不饱和脂肪酸的稳定性 .目前,淀粉脂肪酸复合物的制备主要是以直链淀粉为基质,但其生产过程复杂、花费昂贵,限制了贺志姝等:淀粉油酸复合物构建及其理化性质研
13、究/年第期 工业化应用.与直链淀粉相比,支链淀粉来源丰富、价格低廉,但其高度分支化结构限制了淀粉与脂肪的有效复合.近年来,研究人员利用生物酶法定向修饰支链淀粉的分子结构,以促进其与脂肪酸的复合.例如,王洪玉研究发现,蜡质玉米淀粉经过淀粉蔗糖酶改性后,其延长的分支链能够与月桂酸形成V型复合物,但该V型复合物的结构稳定性较差,这可能是淀粉分支点的空间位阻作用阻碍了淀粉脂肪酸单螺旋的有序性堆积.基于此,本研究通过采用淀粉蔗糖酶与普鲁兰酶联合处理蜡质玉米淀粉,探究淀粉分子结构对淀粉脂肪酸复合物的构建及其理化性质的影响,以期为以支链淀粉为底物制备淀粉脂肪酸复合物提供参考.材料与方法 材料与试剂蜡质玉米淀
14、粉,美国国民淀粉有限公司;油酸(OA),阿拉丁生化科技有限公司;淀粉酶、淀粉转葡萄糖苷酶、普鲁兰酶及葡萄糖氧化酶(G O P O D)试剂盒,爱尔兰M e g a z y m e公司;普鲁兰多糖标样,日本昭和电工科学仪器有限公司;所用试剂未经说明均为分析纯.仪器与设备D P h a s e r型X射线衍射仪,德国布鲁克A X S有限公司;S U 型冷场发射扫描电子显微镜,日本株式会社日立高新技术;A v a n c e MH z全数字化核磁共振波谱仪,德国布鲁克A X S有限公司;X D S C 型差示扫描量热仪,日本精工有限公司;A g i l e n t 高效液相色谱仪,美国A g i l
15、 e n t公司.研究方法 蜡质玉米淀粉酶法支链延长修饰称取 g(干基)蜡质玉米淀粉分散于 m l mm o l/LT r i s HC l(p H )缓冲溶液中,并置于沸水浴中加热糊化 m i n.待冷却至,体系中再加入 m l m o l/L蔗糖溶液以及 U淀粉蔗糖酶,混匀并计时,反应 m i n后煮沸终止反应.所 得 到 的 反 应 产 物 置 于下 过 夜,r/m i n离心 m i n得到改性淀粉沉淀,进行真空冷冻干燥.改性淀粉缩写为M S,其中 代表反应时间.淀粉酶法脱支处理脱支淀粉的制备方法参考K l a o c h a n p o n g等并稍作修改.以M S 为底物,利用普鲁
16、兰酶进行脱支处理,具体实验步骤如下:将g(干基)样品分散在 m l去 离 子 水 中,混 合 后 于 下 加 热 m i n,待降温至 即 取 出,随 后 加 入 m l mm o l/LT r i s HC l(p H );待混合物冷却至 后,加入 U普鲁兰酶,反应h后沸水浴加热灭活终止反应;将反应混合物置于冰箱中过夜,随后 r/m i n离心处理 m i n,所得淀粉沉淀冷冻干燥备用.脱支淀粉缩写为DM S,其中D代表脱支处理.淀粉油酸复合物制备根据王洪玉所述方法制备淀粉油酸复合物并加以调整,将支链延长淀粉和脱支淀粉(m g)分别均匀分散于 m l m o l/LKOH中,同时将 m g油
17、酸溶解于 m l m o l/LKOH中,于 下混合均匀.将上述两种溶液按淀粉油酸为(W/W)混合均匀,在 下反应h,用盐酸将p H值调至 ,产物经三次水洗后离心冻干收集沉淀,所得样品分别命名为:M S OA、DM S OA.以不含油酸的样品为对照组,命名为M S c o n t r o l、DM S c o n t r o l.淀粉支链链长分布测定淀粉支链链长分布的测定采用高效液相体积排阻法(H P S E C).将 m g(干基)淀粉与m l超纯水混合均匀,加入m lDM S O,在沸水中反应h,待降至室温后搅拌过夜,从中吸取m l液体加入m l无水乙醇,混合后 r/m i n离心 m i
18、 n,得到的产物置于通风处过夜使乙醇完全挥发,再分散于 m l煮沸的超纯水中煮沸 m i n,随后在 下恒温,加入 mm o l/L醋酸钠溶液(p H )l以及l普鲁兰酶,持续 h后终止反应,将产物过 m水 系 滤 膜,趁 热 进 样.采 用S h o d e xOH p a k HQ和 HQ色谱柱串联,配备保护柱,柱温为.流动相为 mm o l/L醋酸铵缓冲溶液(p H ),流速 m l/m i n.以不同分子量的普鲁兰多糖为标样,淀粉分支链长度(D P)采用Z h a n g等所述方法进行计算.淀粉分支度测定将 m g样品溶解至(V/V)DM S O dDO混合溶液中,在 下加热至体系呈透
19、明、均匀且无悬浮物的状态.设置温度为,采集时间为 s,弛 豫 时 间 为 s,自 旋 速 度 为 H z,扫描次数为 次,使用M e s t R e N o v a软件分析图谱.淀粉油酸复合物形貌表征 贺志姝等:淀粉油酸复合物构建及其理化性质研究/年第期采用扫描电子显微镜(S EM)表征复合物的表观形貌,取适量样品均匀地涂在样品台上呈薄层状,喷金处理后,调整放大倍数观察其形态.淀粉油酸复合物中油酸分布准确称取m g样品,均匀分散于 l 尼罗红染料中,再加入m l m g/m l乙酸钠缓冲溶液,在黑暗避光环境下静置h;染色结 束后,r/m i n离心 m i n,去除上清液,沉淀用去离子水洗涤三
20、次,再加入 l 异硫氰酸荧光素染料,震荡过夜,于前述相同条件下离心水洗.向沉淀中滴加 l无水乙醇.取一滴于载玻片中心处,立即加盖玻片以固定,倒置放入载物台进行观察,激发波长分别为 、n m.淀粉油酸复合物结晶结构取适量样品平铺在模具上,使其表面平整,厚度均匀.采用X 射线散射仪扫描样品,测定条件为:管压 k V,电流 mA.扫描衍射角范围()为 ,步长 ,每步 s.所得数据使用O r i g i n b软件进行分析,采用高斯拟合法计算相对结晶度.淀粉油酸复合物热力学稳定性测定称取适量样品于铝坩埚中,以(w/v)加入超纯水,密封置于环境下过夜平衡水分.以空坩埚为空白,在差式扫描量热仪中检测样品,
21、设置温度程序为 ,升温速率/m i n.使用仪器自带软件对热谱图进行数据处理,获得淀粉及复合物的热特性参数.淀粉油酸复合物体外消化测定 淀粉油酸复合物中淀粉含量测定将 m g样品溶于m l m o l/LKOH中,混合均匀后加入 m l m o l/L乙酸钠缓冲溶 液(p H );混 合 液 下 恒 温 m i n后,加 入 l淀粉转葡萄糖苷酶,反应h;将反应混合液定容至 m l,涡旋混匀,随后采用G O P O D试剂盒测定葡萄糖质量(mg l u,m g),样品中淀粉含量的计算如下:淀粉含量 mg l uM ()式中,M为淀粉油酸复合物质量,m g;为葡萄糖基转化系数.淀粉油酸复合物体外消
22、化性测定淀粉油酸复合物体外消化性的测定采用E n g l y s t法.在含有mm o l/LC a C l的 m o l/L乙酸钠缓冲液(p H )中加入一定量的 淀粉酶与淀粉转 葡 萄 糖 苷 酶,使 酶 活 分 别 为 U/m l与 U/m l.混匀后,在 水浴中活化 m i n,得到淀粉消化酶液.称取适量复合物样品(含 m g淀粉)分散于m l消化液中,加入颗玻璃珠,并置于 恒温震荡水浴锅中(转速 r/m i n).在预定反应时间点取 l水解液,并加入倍体积的无水乙醇中以终止消化,将所得溶液离心收集上清液(r/m i n,m i n),按上述 节中步骤完成葡萄糖含量的测定.淀粉水解率上
23、清液葡萄糖质量 总淀粉质量 ()淀粉的快消化(R D S)、慢消化(S D S)以及抗性组分(R S)含量分别按下列公式进行计算:R D SG m ()S D S(G G)m ()R S(mG )()式中,m为初始淀粉质量,m g;G 表示消化 m i n时体系中葡萄糖质量,m g;G 表示消化 m i n时体系中葡萄糖质量,m g.实验数据处理与统计分析各组实验无特定说明均重复三次,所得数据使用O r i g i n b进行绘图.使用S P S S 进行统计和差异性分析,显著性界值为P .结果与分析 酶法改性修饰对淀粉分子结构的影响蜡质玉米淀粉(WC S)、M S、DM S 的支链链长分布见
24、图(a).蜡质玉米淀粉的支链链长分布呈现为典型的支链淀粉分布,主峰位于D P 处,副峰位于D P 处.经过淀粉蔗糖酶改性修饰后,M S 的链长分布整体向右偏移,峰值D P由原淀粉的 增至,表明淀粉蔗糖酶的改性修饰显著延长了淀粉分子的支链长度,这与Z h a n g等的研究结果一致.普鲁兰酶能够特异性的水解淀粉分子的 ,糖苷键.如图(b)所示,M S 经过普鲁兰酶脱支处理后,DM S 核磁共振氢谱位于 处 ,糖苷键的化学位移基本消失,证明了淀粉分子的分支点被普鲁兰酶水解.另一方面,DM S 的峰值D P值由M S 的 略微增加至.理论上,普鲁兰酶只作用于淀粉链的分支点,对于淀粉链长并无显著影响.
25、因此,普鲁兰酶脱支处理导致的链长增加可能是由于一部分线性短链易溶于缓冲溶液中,无法通过回生分离,损失在样品制备过程中,这与前人研究结果一致 .贺志姝等:淀粉油酸复合物构建及其理化性质研究/年第期 图改性淀粉支链链长分布图(a)与核磁共振氢谱图(b)淀粉油酸复合物颗粒形貌以及油酸分布淀粉及淀粉油酸复合物的颗粒形貌可用扫描电镜表征.如图所示,蜡质玉米淀粉颗粒多为球形或多 边 形,颗 粒 表 面 光 滑,其 直 径 大 小 为 m,这与前人研究结果一致 .经过淀粉蔗糖酶改性修饰后,M S c o n t r o l呈现为不规则、有棱角的块状结构,且颗粒尺寸超过 m,这与回生直链淀粉的形貌相似.由图可
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- 淀粉 油酸 复合物 构建 及其 理化 性质 研究
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