肝癌标志物受体酪氨酸激酶AXL、软骨寡聚基质蛋白和骨桥蛋白多重检测试剂开发与验证.pdf
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1、698第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 9 期2023-06-08国家科技部生物大分子与微生物组专项(2021YFA1301600)。李思萍,硕士生,Email:。于晓波,研究员,Email:。收稿日期:基金项目:作者简介:通信作者:肝癌标志物受体酪氨酸激酶AXL、软骨寡聚基质蛋白和骨桥蛋白多重检测试剂开发与验证李思萍1,2,韩金育3,胡迪4,王雅杰3,于晓波1,21.温州医科大学第一临床医学院(信息与工程学院),浙江温州325035;2.国家蛋白质科学中心-北京(凤凰中心)北京蛋白质组研究中心,北京102206;3.首都医科大学附属北京地坛医院检验科,北京100015;4.旦生(
2、北京)医学科技有限责任公司,北京102206摘 要 目的:基于流式荧光技术开发血清中肝癌标志物受体酪氨酸激酶AXL、软骨寡聚基质蛋白(COMP)和骨桥蛋白(OPN)的多重检测试剂。方法:建立检测血清甲胎蛋白(AFP)、AXL、COMP和OPN的流式荧光免疫法,并进行检测性能分析,筛选两个队列的肝癌血清样本进行临床验证并初步探讨四项标志物对肝癌的诊断价值。结果:AFP、AXL、COMP和OPN的检测范围依次为0.046100.000、0.01430.000、0.00715.000、0.02350.000ng/mL,最低检测限依次为0.010、0.014、0.004、0.007ng/mL,批内精密
3、度8%,批间精密度5%,回收率为84%101%,线性度为95%102%。AXL、COMP和OPN之间没有观察到交叉反应。流式荧光免疫法与临床化学发光免疫法具有显著相关性(r=0.995,P0.001)。肝癌血清AFP、AXL、COMP和OPN水平均高于健康对照,差异有统计学意义(P0.01)。针对所有血清样本(n=100),绘制肝癌与健康对照的受试者工作特征(ROC)曲线,血清OPN的曲线下面积(AUC)为0.913,在单项标志物中,OPN对肝癌的诊断效果最佳;AFP、AXL和OPN组合的AUC为0.937,AFP、AXL、COMP和OPN组合的AUC为0.940。结论:本研究建立了四项肝癌血
4、清标志物联合检测方法。AXL、COMP和OPN是诊断肝癌的潜在血清标志物,AXL、OPN与AFP联合检测的肝癌预测模型展示出较好的检测性能。结果对进一步开发其他标志物的多重检测试剂具有重要的参考价值。关键词 肝癌;甲胎蛋白;AXL;软骨寡聚基质蛋白;骨桥蛋白中图分类号R735.7 DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2023.09.002Development and validation of the multiplex immunoassay of serum markers for liver cancer:receptor tyrosine kinase AXL,
5、cartilage oligomeric matrix protein and osteopontin LI Siping1,2,HAN Jinyu3,HU Di4,WANGYajie3,YUXiaobo1,2.1.TheFirstSchoolofMedicine,SchoolofInfomationandEngineering,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.NationalCenterforProteinScience-Beijing(PhoenixCenter),BeijingProteomicsResearchCenter,
6、Beijing102206,China;3.DepartmentofLaboratory,BeijingDitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100015,China;4.ProteomicsEraMedicalLtd.,Beijing102206,China Abstract:Objective:To develop a multiplex immunoassay of serum receptor tyrosine kinase AXL,cartilage oligomeric matrix protein(COM
7、P)and osteopontin(OPN)for liver cancer detection.Methods:We developed a multiplex immunoassays containing alpha-fetoprotein(AFP),AXL,COMP and OPN using flow cytometry,which was tested on their performance in detecting liver cancer patients from two clinical cohorts.Results:The detection range for AF
8、P,AXL,COMP and OPN was respectively 0.046-100.000,0.014-30.000,0.007-15.000 and 0.023-50.000 ng/mL while the 1imit of detection was 0.010 ng/mL for AFP,0.014 ng/mL for AXL,0.004 ng/mL for COMP and 0.007 ng/mL for OPN.The intra-assay and inter-assay were below 8%and 5%,respectively.The recovery rate
9、was 84%-101%,and the linearity was 95%-102%.The measurement for AXL,COMP and OPN showed that there was no significant cross-talking reaction.There was a high correlation between flow immunoassay and clinical chemiluminescence immunoassay(r=0.995,P0.001).The level of AFP,本文引用:李思萍,韩金育,胡迪,等.肝癌标志物受体酪氨酸激
10、酶AXL、软骨寡聚基质蛋白和骨桥蛋 白多重检测试剂开发与验证J.温州医科大学学报,2023,53(9):698-705,713.论 著Vol.53 No.9Sep.2023第53卷第9期2023年9月温 州 医 科 大 学 学 报Journal of Wenzhou Medical University699第 9 期第 53 卷AXL,COMP and OPN in liver cancer was all higher than that in healthy control,and the difference was statistically significant(P0.01).I
11、n all serum samples(n=100),when receiver operating characteristic(ROC)curve was plot-ted for liver cancer versus healthy control,among the single markers,serum OPN with AUC 0.913 had the best diagnosis performance for liver cancer.The combination of AFP,AXL,OPN with area under the curve(AUC)0.937 an
12、d the combination of four markers with AUC 0.940 had comparable diagnosis performance.Finally,AFP,AXL and OPN were used to generate liver cancer prediction model.Conclusion:We have successfully developed the assays for detecting four serum markers in HCC.AXL,COMP and OPN are potent serum markers for
13、 detection of liver cancer,and the liver cancer prediction model based on the combined of AXL,OPN and AFP showed excellent diagnostic performance.The results have important reference value for the further development of multiplex assay reagents for other markers.Key words:liver cancer;alpha-fetoprot
14、ein;AXL;cartilage oligomeric matrix protein;osteopontin肝癌是高度致命的恶性肿瘤之一1,肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌。当前,常用于肝癌诊断的血清学标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)虽被广泛应用,但应用存在局限性2-3。肝癌相关指南建议对AFP阴性人群可以增加检测异常凝血酶原(des-carboxy-prothrombin,DCP)、甲胎蛋白异质体3(alpha-fetoproteinlensculinarisagglutinin3,AFP-L3)、miRNA
15、(microRNA)检测试剂盒和GALAD模型等,从而提高肝癌检出率,但可能由于灵敏度或特异度有限、检测成本高等原因,仍未广泛应用于临床,迫切需要探索新型有效标志物来提供肝癌相关肿瘤信息。受体酪氨酸激酶AXL、软骨寡聚基质蛋白(cartilageoligomericmatrixprotein,COMP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是近年来分别被发现,并经临床样本验证的新型肝癌标志物,联合AFP检测可以提高肝癌诊断性能4-6。但多数研究只是针对其中一种标志物与AFP联合检测,以上三项标志物与AFP结合对肝癌的诊断价值鲜见报道。以往这几种标志物的检测多采用酶联免疫吸附试验(enzy
16、me-linkedimmunosorbentassay,ELISA)7-9,但ELISA样本用量大、操作繁琐且不能实现多重检测。流式荧光技术利用不同荧光编码微球实现单次实验多项标志物同时检测,其检测灵敏度高、特异性强、分析速度快、标志物组合灵活等优势10-11,可以节约试剂用量和人力成本。本研究基于流式荧光技术建立多重肝癌标志物检测方法,并进行检测性能分析,筛选肝癌血清样本进行临床验证并初步探讨四项标志物对肝癌的诊断价值。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 标本:标本取自2019年6月至2022年1月在首都医科大学附属北京地坛医院被诊断为HCC的患者及同期体检的健康对照者。训练队列有30例健
17、康对照者(男/女:21/9,年龄2183岁)和30例HCC患者(男/女:23/7,年龄3575岁)。验证队列有20例健康对照者(男/女:13/7,年龄2584岁)和20例HCC患者(男/女:15/5,年龄3266岁)。HCC组纳入标准:患者均为新诊断且未接受过治疗。HCC组排除标准:血清采集前接受过抗癌治疗的患者和有其他肿瘤病史的患者。健康对照组纳入标准:肝脏生化指标正常且肝炎病毒血清学阴性;无肝脏和胃肠道疾病及恶性肿瘤病史。所有血清样品在冰上解冻,涡旋510s,在4条件下1 500g离心10min,将上清液分装后用于检测,剩余样本-80保存。本研究经首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会审核
18、批准(编号:DTEC-KT2022-006-01),同时签署了免知情同意书。1.1.2 主要试剂及仪器:人AXL、COMP、OPN标准品及抗体对购自美国R&Dsystems公司,人AFP标准品及抗体对购自杭州博岳生物技术有限公司,2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)水合物购自美国Sigma-Aldrich公司,1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自北京索莱宝科技有限公司,N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)购自美国ThermoScientific公司,EasyMagPlex磁性荧光编码微球、流式细胞仪、磁力板均购自深圳唯公科技有限
19、公司。1.2 方法1.2.1 血清样本检测:磁性荧光微球成功连接捕获抗体后,向反应板每孔内分别加入50L微球悬液和50L血清稀释液(AFP以1:20稀释,AXL、COMP、OPN以1:30稀释)或标准品或空白对照,室温 李思萍,等:肝癌标志物受体酪氨酸激酶AXL、软骨寡聚基质蛋白和骨桥蛋白多重检测试剂开发与验证700第 53 卷温 州 医 科 大 学 学 报第 9 期振荡孵育2h,洗涤液清洗2次;每孔加入50L生物素标记的检测抗体而形成双抗体夹心形式,室温振荡孵育1h,洗涤液清洗2次;每孔加入50L稀释后的SA-PE,室温振荡孵育0.5h,洗涤液清洗2次;200L检测缓冲液重悬微球,用Easy
20、Cell流式细胞仪的不同激光同时对羧基微球上的分类荧光和检测抗体上的标记荧光进行检测,对待测靶标分子进行分类和定量,实现多项肝癌标志物同时检测12。1.2.2 方法学建立:根据唯公羧基编码微球使用说明书,取四种不同荧光比例的微球各100L(8106beads/mL),洗涤后加入Sulfo-NHS、EDC活化30min;以MES为反应缓冲液,分别向每种微球悬液中加入5.6g对应的捕获抗体孵育2h;用Tris缓冲液反应10min,直接加入封闭缓冲液摇床混匀封闭14h;于次日用种属与微球结合的捕获抗体种属来源匹配的生物素化抗鼠IgG以及SA-PE来验证微球偶联效率;利用四项标志物进行预实验,根据中值
21、荧光强度(medianfluorescenceintensity,MFI)优化检测抗体和SA-PE的工作浓度以及依次加入蛋白、检测抗体和SA-PE的孵育时间等实验条件,建立定量检测肝癌血清标志物的流式荧光免疫法。1.2.3 方法学性能分析:交叉反应:使用3个测试评估交叉反应性13,多重偶联微球、单个抗原和单个检测抗体,用于确定蛋白是否与非靶标偶联微球结合;多重偶联微球、单个抗原和多重检测抗体,用于确定检测抗体是否与非靶标蛋白发生交叉反应;多重偶联微球、多重抗原和多重检测抗体,用于确认多重测定中不存在交叉反应。检测范围:结合灵敏度和最高检测限得到检测范围。灵敏度:以样本稀释液为空白对照,测定3个
22、空白对照的MFI值,计算其均值()和标准偏差(s),以空白检测限(limitofblank,LoB)=+2s13和最低检测限(limitofdetection,LoD)=+2s14分别代入标准曲线中计算对应浓度值。精密度:检测高、低两个浓度的样本,每个浓度11个重复,进行3次独立实验。根据变异系数(coefficientofvariation,CV)公式:CV(%)=s/100%,计算精密度。回收率与线性度:以人混合血清样本为未掺入组,向人混合血清样本加入已知浓度的标准品作为掺入组,向稀释液中加入已知浓度的标准品作为对照组。根据样本测定浓度值计算相应的回收率和线性度,回收率(%)=(掺入组未掺
23、入组)/对照组100%,以掺入组的样本计算线性度,线性度(%)=稀释样本稀释倍数/未稀释样本100%。1.2.4 方法学初步应用:本研究以训练队列和验证队列作为研究对象,流式荧光免疫法测定同一批血清样本中四项蛋白浓度,比较HCC组与健康对照组的组间差异,分析流式荧光免疫法与化学发光免疫法检测AFP水平的一致性,受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线用于评估标志物在HCC中的诊断性能,二元Logistic回归分析用于构建标志物联合检测模型,以探讨流式免疫荧光法检测四项肝癌标志物在诊断中的初步应用。1.3 统计学处理方法 使用SPSS25.0、
24、GraphPadPrism8.0软件进行统计分析。两种方法的一致性分析采用Pearson相关;标志物检测结果以M(P25,P75)表示,两组间比较采用Mann-WhitneyU检验;标志物诊断性能评估采用ROC曲线分析;标志物联合检测模型构建采用二元Logistic回归分析;标志物间的交叉反应图采用Excel绘制。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 微球偶联验证 在分析开发之前进行微球偶联效率评估,以MFI为纵坐标,抗鼠IgG浓度值为横坐标,采用四参数Logistic回归模型分别绘制AFP、AXL、COMP和OPN的曲线。随着生物素标记的抗鼠IgG浓度不断增加,相应的MFI信号值也会
25、增加(见图1)。四项标志物的最高MFI信号均在170 000以上在设置的光电倍增管(photomultipliertube,PMT)下,饱和状态最高MFI信号值在200 000左右,说明四项标志物的捕获抗体已经成功连接在微球上。2.2 检测性能2.2.1 交叉反应:分析肝癌标志物AXL、COMP和OPN之间的交叉反应性,显示三个靶标蛋白之间不存在交叉反应(见图2),可以实现三项标志物同时检测。2.2.2 标准曲线:标准曲线对定量测量至关重要,以MFI为纵坐标,标准品浓度值为横坐标,采用四参数Logistic回归模型绘制AFP、AXL、COMP和OPN的标准曲线(见图3)。四项标志物标准曲线相关
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