和田羊FGF5基因RNA干扰载体构建及筛选.pdf
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1、和田羊FGF5 基因 RNA 干扰载体构建及筛选2023 年 第 9 期和田羊FGF5 基因 RNA 干扰载体构建及筛选曹少奇1,陈岩2,高新梅1,喻恒彬2,王静2*,胡广东2*(1.新疆维吾尔自治区畜牧总站,新疆 乌鲁木齐 830000;2.石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832061)摘 要:试验旨在构建并筛选出高效的和田羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因的RNA干扰载体,根据和田羊FGF5基因序列,设计4条短发夹RNA(shRNA)干扰片段和1条阴性对照片段。扩增后克隆至pGPU6载体,获得 4 个重组质粒 pGPU6-shRNA-FGF1、pGPU6-shRNA-FGF2、p
2、GPU6-shRNA-FGF3、pGPU6-shRNA-FGF4和阴性对照质粒pGPU6-shRNA-FGF5。通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序对质粒进行酶切鉴定和测序鉴定。鉴定后的质粒通过电刺激法转染至和田羊成纤维细胞,通过qRT-PCR和Western Blotting(WB)分析FGF5基因的表达情况。结果显示,与阴性载体相比,4个RNA干扰表达载体均可显著降低FGF5 mRNA和蛋白的表达量(P0.05),其中pGPU6-shRNA-FGF3干扰效率最高,为85.20%。研究表明,FGF5干扰表达载体构建成功并可有效干扰和田羊FGF5基因表达。关键词:和田羊;RNA干扰;FGF5基因;载
3、体构建;成纤维细胞中图分类号:S 813.1 文献标识码:A 文章编号:1672-9692(2023)09-0032-05Construction and screening of RNA interference vector aimed at Hotan sheep FGF5 geneCao Shaoqi1,Chen Yan2,Gao Xinmei1,Yu Hengbin2,Wang Jing2*,Hu Guangdong2*(1.Xinjiang Animal Husbandry Station,Xinjiang Urumqi 830000;2.College of Animal Sci
4、ence and Technology,Shihezi University,Xinjiang Shihezi 832061)Abstract:The aim of the experiment was to construct and screen out efficient RNA interference vectors of Hotan sheep FGF5 gene.According to the FGF5 gene sequence of Hotan sheep,four shRNA interference fragments and one negative control
5、fragment were designed.Four recombinant plasmids pGPU6-shRNA-FGF1,pGPU6-shRNA-FGF2,pGPU6-shRNA-FGF3,pGPU6-shRNA-FGF4 and negative control plasmid pGPU6-shRNA-FGF5 were obtained.The plasmid was identified by enzyme digestion and DNA sequencing by agarose gel electrophoresis.The identified plasmids we
6、re transfected into Hotan sheep fibroblasts by electrical stimulation,and the expression of FGF5 gene was analyzed by qRT-PCR and WB.The results showed that compared with the negative vector,the four RNA interference expression vectors could significantly reduce the expression levels of FGF5 mRNA an
7、d protein(P0.05),and pGPU6-shRNA-FGF3 had the highest interference efficiency(85.20%).The study indicates that the FGF5 interference vector is successfully constructed and can effectively interfere with FGF5 gene expression in Hotan sheep.Key words:Hotan sheep;RNA interference;FGF5 gene;Vector const
8、ruction;Fibroblast和田羊是历史悠久的地方半粗毛羊品种,但由于育种工作落后,导致生产性能发生退化。因此,对控制和田羊羊毛的性状相关基因进行深入研究,进一步改善和田羊的羊毛品质,对和田羊种质资源的开发与保护具有重要意义1。毛囊是支持哺乳动物毛发形成和生长的重要器官,其周期受血管内皮细胞生长因子2、骨形态发生蛋白43、胰岛素样生长因子 14、FGF55等多种信号分子的调控,FGF5是控制毛囊从生长期向退行期转换的关键因子6。FGF5由3个外显子和两个内含子构成,具有调控毛囊周期收稿日期:2022-12-08作者简介:曹少奇,硕士,畜牧师,研究方向为动物遗传育种与繁殖、畜牧业技术推广
9、。通讯作者:王静,博士,副教授,研究方向为动物生理学;胡广东,博士,副教授,研究方向为动物胚胎工程、动物生物技术。基金项目:新疆维吾尔自治区多浪羊品种选育推广技术体系专项(2021DLY-23);兵团重点领域科研攻关计划项目肉羊健康养殖模式关键技术集成创新与示范(2021AB014)32现代畜牧兽医2023 年 第 9 期的功能,是调节毛发生长的重要因子之一。在对小鼠、驴、犬、猫、人的试验中均发现FGF5基因的表达量与毛发生长有关,也有研究发现FGF5基因的表达与绒山羊的羊绒生长有关7。综上,沉默或敲除FGF5因子研究其对动物产毛性状的影响,对提高产毛动物的毛产量具有重要意义。对绒山羊中使用R
10、NAi技术进行FGF5敲除试验,结果表明,RNAi技术可有效降低FGF5的表达8-9,且FGF5敲除后对绒山羊的血液生理生化指标10、发情能力11无显著影响。本研究中设计并合成了4个shRNA,将其与pGPU6/GFP/Neo质粒连接构建干扰表达载体,将干扰载体转染至和田羊成纤维细胞,检测其对和田羊FGF5基因的mRNA和蛋白表达水平的干扰效率,筛选出干扰效率最强的shRNA,为进一步探讨和田羊中FGF5基因的作用机制、改善和田羊毛质量奠定基础。1材料与方法1.1试验材料试验用和田羊由石河子大学兽医站饲养,剪取和田羊耳部组织分离培养获得成纤维细胞。大肠杆菌DH5购自天根公司;质粒pGPU6/G
11、FP/Neo购自上海吉玛技术有限公司。胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco;20PBS、质粒提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司);青霉素-链霉素(HyClone);Trizol(Invitrogen 公司);反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(TaKaRa公司);抗GADPH鼠单克隆抗体、抗FGF5鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(Abcam公司)。CO2培养箱(Thermo公司)、超净工作台(日本日立公司)、LightCycler 96实时荧光定量PCR仪(罗氏公司);垂直电泳仪、凝胶成像系统、半干转膜仪(美国BIO-RAD公司);水平板电泳仪(上
12、海天能科技有限公司)。1.2和田羊FGF5基因靶向寡核苷酸的设计与制备依据和田羊FGF5基因CDS区与shRNA的设计原则,使 用 Life Technologies 公 司 网 站(http:/www.lifetech- shRNA target design工具,设计得到4条长度为54 bp的shRNA干扰片段 PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4 和 1 条长度为 51 bp 的阴性对照片段 PR-FGF5,片段序列信息见表1。shRNA干扰片段上下游分别引入BamH 酶切位点和Bbs 酶切位点,由上海生工生物工程有限公司合成相应的shDNA单链。1.3RNA干
13、扰载体的构建将所得的单链 shDNA 使用 20 L 体系(Sense 1 L、10SSC 1 L、Anti-Sence 1 L、ddH2O补齐)进行退火连接;反应条件为95 变性10 min,室温冷却1 h;获得双链shDNA。4 条干扰片段分别命名为 shRNA-FGF1、shRNA-FGF2、shRNA-FGF3、shRNA-FGF4,阴性对照片段命名为shRNA-FGF5。使用限制性内切酶BamH 和Bbs 对质粒pGPU6/GFP/Neo进行双酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收,得到线性化的质粒 pGPU6/GFP/Neo。将合成的5条双链shDNA,分别与线性化的pGP
14、U6/GFP/Neo质粒4 过夜连接,连接产物转化入感受态细胞中,过夜挑取单菌落至培养管,摇菌扩大培养,进行质粒提取后获得重组质粒。重组质粒利用BamH 进行单酶切鉴定后,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,送至上海生工生物工程有限公司测序。1.4重组质粒酶切鉴定重组质粒酶切体系为:10buffer H 1 L,BamH 酶0.5 L,BSA(10 g/L)0.25 L,质粒4 L,灭菌超纯水补至10 L。离心混匀后,置37 水浴2 h;65 经10 min灭活内切酶,10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5细胞培养和细胞转染采取和田羊耳部组织块,使用PBS溶液(含有50万单位青霉素-链霉素)清洗,之后用75
15、%酒精浸泡2 min,再次使用PBS溶液仔细清洗。在超净工作台中将组织块表皮表1FGF5 RNA干扰片段序列信息Tab.1FGF5 RNA interference fragment sequence information编号PR-FGF1PR-FGF2PR-FGF3PR-FGF4PR-FGF5序列信息GCTCCCACGAAGCCAATATGTTTCAAGAGAACATATTGGCTTCGTGGGAGCTTGCACGTCTCTACCCACTTTCTTTCAAGAGAAGAAAGTGGGTAGAGACGTGCTTGGAACTTTCTTTCACAGTTACTTCAAGAGAGTAACTGTGAA
16、AGAAAGTTCCTTGCATCGGTTTCCATCTGCAGATTCAAGAGATCTGCAGATGGAAACCGATGCTTGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATT片段长度/bp5454545451332023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine去除,在PBS溶液中将组织块剪碎至糊状,使用PBS溶液离心清洗35遍,胰酶消化后再次使用PBS溶液离心清洗35遍,将清洗后的组织块种至60 mm培养皿中,在细胞培养箱(37、5%CO2)中放置
17、5 min,待组织块贴壁后取出,在培养皿中添加含有10%FBS的DMEM/DF12完全培养基(含有20万单位青霉素-链霉素),放入细胞培养箱中培养,2 d后更换培养基,4 d后可见耳部组织块周围迁移出成纤维细胞,2 d更换一次培养基继续培养至细胞数量可用。利用电刺激转染的方式将5种RNA干扰载体转染至成纤维细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白GFP6表达情况。1.6RT-PCR检测FGF5 mRNA表达水平电转染24 h后,使用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA,反转录为 cDNA 通过 RT-PCR 检测细胞样品中FGF5基因表达量,重复3次。定量引物序列为:AAGAC-TGGGCGGGA
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