隔药饼灸调控子宫内膜异位症小鼠磷脂酰肌醇3激酶信号通路的研究.pdf
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1、基金项目:江西省教育厅科技项目(,)作者简介:辛卉(),女,硕士研究生在读,研究方向:隔药饼灸治疗子宫内膜异位症的作用与机制研究,:通信作者:周志刚(),男,博士,教授,研究方向:灸法的作用规律和机制研究,:隔药饼灸调控子宫内膜异位症小鼠磷脂酰肌醇 激酶信号通路的研究辛卉周平生徐鹏周志刚(江西中医药大学研究生院,南昌,;江西中医药大学国际教育学院,南昌,;江西中医药大学中医学院,南昌,)摘要目的:探讨隔药饼灸调控子宫内膜异位症()小鼠对子宫内膜磷脂酰肌醇 激酶()信号通路表达的影响。方法:将 只 周龄雌性重度联合免疫缺陷病()小鼠按照随机区组分组法分为正常组()和造模组()。造模组小鼠均采用
2、自体移植法进行造模,按照随机数字表法选取 只小鼠验证造模成功后,按随机区组分组法分成 模型组、隔药饼灸组、西药组和艾灸加西药组 组,每组 只,并给予相应治疗。观察评估各组小鼠扭体反应及囊泡抑制率,采用蛋白质印迹法检测小鼠异位内膜组织中 、蛋白激酶 ()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()的表达。结果:与正常组比较,模型组、西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠的扭体反应次数升高,差异均有统计学意义(均 ),与西药组比较,隔药饼灸组和艾灸加西药组扭体反应次数下降,差异均有统计学意义(均 );与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组治疗前后异位子宫组织体积明显缩小,差异均有统计学意义(均 );与模型组
3、异位内膜组织比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组异位内膜组织中的 、表达降低,差异均有统计学意义(均 );与隔药饼灸组比较,西药组、艾灸加西药组异位内膜组织中的 、表达均升高,差异均有统计学意义(均 )。结论:隔药饼灸可能是通过下调小鼠子宫异位内膜组织 高表达而达到镇痛和抑制囊泡生长作用。关键词隔药饼灸;子宫内膜异位症;信号通路;痛经;关元 ,(,;,;,):()():():()(),(),():,(),(),(),(),():;中图分类号:文献标识码:子宫内膜异位症(,)是妇科常见病,疼痛是其最常见的临床症状,并伴有其他症状,如盆腔包块、性交痛和不孕等,对女性日常生活有严重影响 。目前 的
4、发病机制尚不明确,但大部分学者认为黏附、侵袭、血管生成是 的基本病理过程。中医认为 病机多为瘀血阻滞于胞宫,冲任失调所致 。有研究证明艾灸结合药物治疗对于 患者治疗效果优于单纯针刺患者 。研究表明 的形成与多条信号通路相关,其中磷脂酰肌醇 激酶 蛋白激酶 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(,)信号通路在 发生发展过程中发挥了重要作用 。本研究旨在通过观察隔药饼灸关元穴对于子宫内膜异位导致的痛经小鼠子宫 、表达的影响,阐明隔药饼灸对于 信号通路的影响与隔药饼灸治疗 的作用机制。材料与方法 材料 动物选用雌性重度联合免疫缺陷病(,)小鼠 只,周龄,体质量 ,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,动物许可证号
5、:(湘),符合动物实验标准,在江西中医药大学实验动物科技中心提供的无特定病原体(,)级实验室内饲养。饲养条件:每笼 只,光照 黑暗,室温(),相对湿度 ,排风压差 ,灭菌饲料自由进食进水。本研究通过江西中医药大学实验动物伦理委员会审批(伦理审批号:)。药物药饼(将附子、肉桂、红花、丹参、木香、当归按照质量 的比例制成药粉,以黄酒调和做成直径约 ,厚度约 大小的药饼);艾 绒(江 西 鄱 艾 科 技 有 限 公 司,批 号:);缩宫素注射液(上海上药第一生化药业有限公司,批号:);戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司,批号:);达那唑胶囊(江 苏 联 环 药 业 股 份 有 限 公 司,
6、批 号:)。试剂与仪器 蛋白定量试剂盒(批号:)、超敏发光试剂盒(批号:)、电 泳 液(批 号:)、转 膜 液(批 号:)、彩色预染蛋白质分子量标准(批号:)、辣根过氧化物酶标记抗兔 抗小鼠二抗(批号:),以上试剂均购自上海威奥生物科技有限公司。小型垂直电泳槽(型号:)、迷你湿转印槽(型号:)、基础电源(型号:),以上仪器均购自美国 伯乐公司;组织匀浆器(北京鼎昊源公司,型号:);全波长酶标仪(,美国,型号:)。方法 分组与模型制备将 只小鼠适应性饲养后,根据随机区组分组法将小鼠分为正常组()和造模组()。除正常组外,造模组均参照造模方法建立子宫内膜异位小鼠模型 ,手术前 给予补佳乐 灌胃,使
7、小鼠处于统一动情期(阴道涂片为大量无核角化细胞)。采用 戊巴比妥钠溶液()腹腔注射麻醉小鼠,纵向切开腹壁,暴露左侧子宫,并结扎子宫两端,取中间一段子宫;纵向剖开取出的子宫,将子宫内膜及肌层分离成大小为 的片段,用 无菌眼科线将子宫内膜面固定于腹腔内壁上,并在腹腔内适量撒入头孢氨苄胶囊粉末,最后逐层关腹、消毒。后随机挑选 只造模的小鼠,颈椎脱臼法处死观察病灶处内膜形态和体积,当病灶部位出现直径 的半透明囊肿,内有液体积聚,并且有血管形成,则提示造模成功。随后按照随机区组分组法分为 组:模型组、西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组,每组 只。给药方法)造模结束后第 天起,隔药饼灸组小鼠在关元穴进行隔药
8、饼灸,次 ,每只灸壮 次,持续时间约 ,连续 。)造模结束后第 天起,艾灸加西药组先给予达那唑混悬液(以 给药)灌胃,而后再在关元穴隔药饼灸,次 ,每只 壮 次,连续 。)造模结束后第 天起,西药组每天给予达那唑混悬液(以世界中医药 年 月第 卷第 期 给药)灌胃,连续 。)造模结束后第 天起,正常组和模型组均给予等容积的生理盐水灌胃,连续 。取材末次治疗 后,在无菌条件下开腹,暴露腹腔后找到并分离出异位子宫内膜组织,使用磷酸盐缓冲溶液(,)缓冲液清洗后,存于 冰箱用于后续蛋白质印迹法()实验检测。检测指标与方法 小鼠扭体反应自治疗第 天起,每次治疗结束 后,通过对小鼠注射 个单位缩宫素后观察
9、并记录 内小鼠扭体反应的次数。小鼠扭体反应的标准为:小鼠躯干伸展,腹部双侧向内凹同时收缩,一侧后肢与臀部发生内旋 。小鼠子宫异位组织(囊泡)体积及其抑制率造模周后,在无菌条件下开腹,用游标卡测量并记录异位内膜(囊泡)的体积长()宽()高();末次治疗 后,麻醉小鼠后逐层开腹,观察异位子宫组织(囊泡)形态及大小并测量其长、宽、高(),计算其体积及抑制率 :异位内膜组织(囊泡)生长抑制率(治疗前异位内膜组织体积 治疗后异位内膜组织体积)治疗前异位内膜组织体积 。蛋白质印迹法检测用酶抑制剂三联装提取小鼠子宫内膜异位组织总蛋白,用蛋白质定量试剂盒(,)法测出其总蛋白浓度。采用蛋白质印迹法,经电泳、转膜
10、、封闭后加入 、甘油醛 磷酸脱氢酶(,)一抗孵育()过夜后,再洗膜后继续二抗孵育(),再进行洗膜、曝光显影、定影,分析蛋白表达水平。统计学方法采用 统计软件进行数据分析,符合正态分布数据以均数 标准差(珋 )表示,采用单因素方差分析,不符合正态分布数据采用非参数检验(),通过克鲁斯卡尔 沃利斯()检验多组或 组间两两比较,以 为差异有统计学意义。结果 各组小鼠扭体反应结果与正常组比较,模型组、西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠扭体反应次数增多,差异有统计学意义();与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠扭体反应次数低于模型组,差异有统计学意义();与西药组比较,隔药饼组、艾灸加西
11、药组小鼠扭体反应次数减少,差异有统计学意义()。见表 。表 各组小鼠扭体反应结果(珋 ,次,)组别扭体反应次数正常组模型组 隔药饼灸组 西药组 艾灸加西药组 注:与正常组比较,;与模型组比较,;与西药组比较,各组小鼠生长抑制率和异位组织体积比较西药、隔药饼灸、艾灸加西药均可以缩小囊泡生长体积,隔药饼灸组与艾灸加西药组小鼠囊泡生长抑制率低于西药组小鼠;与模型组比较,西药组、隔药饼灸组、艾灸加西药组小鼠治疗后异位子宫组织体积均减小(均 );与西药组比较,隔药饼灸组和艾灸加西药组小鼠治疗后异位子宫组织体积均减小();隔药饼灸组小鼠与艾灸加西药组比较,差异无统计学意义()。见表 ,图 。表 各组小鼠生
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