高温大曲制曲过程中水解酶系及理化性质的动态变化研究.pdf
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1、文章编号:1002-8110(2023)04-0031-06第 50 卷 第 4 期2 0 2 3 年 7 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.4July,2023高温大曲制曲过程中水解酶系及理化性质的动态变化研究*袁华伟1,2,赵余2,王玉婷2,冉茂芳1,张立强1,陈思羽2,吴秋渧2,尹礼国2,沈才洪1,王松涛1*(1.泸州品创科技有限公司/泸州老窖股份有限公司/国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州646000;2.宜宾学院质量管理与检验检测学部/固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾644000)摘要:为研究高温大曲在制曲过程中酶活力及理化指标的变化规律,对高温大曲制曲周期内
2、 8 种主要水解酶系酶活力及其理化性质进行了测定。结果表明,随着制曲时间的延长,高温大曲液化酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶的酶活力以及发酵力、酯化力整体呈现先上升后下降再上升的趋势;理化指标中还原糖和酸度在制曲前期均有一定程度的提升,在制曲后期逐渐下降,而水分和淀粉的含量整体呈现下降的趋势。该研究结果可为高温大曲制曲过程工艺控制和质量标准体系的建立提供技术支撑。关键词:高温大曲;酶活力;理化指标;制曲中图分类号:TS262.3;TS261.11;TS261.4;TS201.2文献标识码:A高温大曲是生产酱香型白酒的糖化发酵剂,其质量直接影响酱香型白酒的品质。高温大曲的
3、制曲原料以小麦为主,包含淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素和半纤维素等多种成分。高温大曲在制作和贮存时微生物会分泌液化酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶等多种水解酶,这些水解酶系不仅在对原料的利用方面发挥着重要作用,对白酒风味的形成也有重要贡献1,2。研究发现,酶活力随大曲培养及贮存时间的改变也会发生变化3,4。大曲的理化指标反映其品质的差异。大曲储存时间越长,成曲水分含量越低,即成熟度越好5。大曲中适量的酸度是多种微生物共同作用的结果,可抑制部分有害杂菌的生长繁殖,是生成对应酯类的前驱物质,同时也是赋予酒体愉快香气的重要成分6。制曲过程淀粉消耗率越高,微生物种群的繁殖和代谢作用
4、程度越强,代谢产物越丰富,是复合曲香物质生成积累的重要途径,同时淀粉消耗的多少也是判定大曲发酵优劣的一个重要指标7。还原糖不仅为大曲微生物提供碳源,也是美拉德反应的主要反应物。美拉德反应的产物不仅是酒体呈香和呈味的微量成分,同时也作为其他香味物质的前驱物质8。由于大曲开放型的制曲工艺、自然接种方式、微生物及酶系的多样性,至今对制曲过程大曲中各种微生物及酶类的形成机理及其在酿酒发酵过程中的作用机制尚未完全研究透彻。目前对高温大曲的研究主要集中在功能微生物菌群及其酶系9-12、挥发性成分13-15和贮存期质量变化规律4等方面。以高温大曲整个制曲过程为研究对象,全面分析制曲过程水*基金项目:国家固态
5、酿造工程技术研究中心开放课题(2021-130);四川省科技厅科研项目(2021YFH0021,2022YFH0050);固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目(2019GTJ007,2022GTYY02);宜宾学院科研项目(2022YY03)收稿日期:2023-04-17作者简介:袁华伟,教授,博士,研究方向为白酒微生物发酵。*通讯作者:王松涛,正高级工程师,博士,研究方向为白酒生产技术。E-mail:。科学实验 本栏目由独家支持31解酶类与理化指标变化的研究较少。本研究通过对高温大曲整个制曲过程不同阶段的酶活力和理化指标进行测定,探究制曲过程中水解酶系液化酶、糖化酶、纤维素酶、半纤维
6、素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶酶活力,发酵力、酯化力及理化指标酸度、水分、还原糖、淀粉的变化规律,旨在揭示制曲过程不同生物酶活力及理化指标存在明显差异的本质原因,为科学指导传统制曲工艺提供数据支撑,为提升高温大曲的质量奠定基础。1材料与方法1.1材料、试剂无水乙酸钠、冰乙酸、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸氢钠、盐酸、羧甲基纤维素钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙醇、己酸、磷酸二氢钠、碘、三氯乙酸、碳酸钠、乳酸、乳酸钠、可溶性淀粉、木糖、葡糖糖、福林酚,均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂。淀粉酶、糖化酶、酪蛋白、酪氨酸,北京奥博星生物技术有限责任公司。木聚糖,美国Sigma-Ald
7、rich 公司。1.2仪器和设备UV-1800 紫外可见分光光度计,上海美析仪器有限公司;TG1650-WS 台式高速离心机,上海精密仪器仪表有限公司;SSW-600-2S 恒温水浴锅,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;DSX-30L 高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;HPX-150恒温培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;ME204E分析天平,梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;PHS-3E 酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;DHG-9240A 台式恒温鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司。1.3分析方法1.3.1高温大曲样品的
8、采集高温大曲样品来源于川南酱香白酒生产企业的制曲过程。从曲房对不同制曲期进行定时取样,将采集的整块大曲进行粉碎,并全部过 40 目筛,采用四分法混合均匀后,将大曲样品装入无菌袋中,于-80保存备用。1.3.2高温大曲理化指标测定大曲中水分、酸度和淀粉含量测定参照 QB/T42572011 酿酒大曲通用分析方法16。还原糖含量的测定参照 GB 5009.72016食品安全国家标准 食品中还原糖的测定17。1.3.3高温大曲酶活测定大曲液化力、糖化力、发酵力、酯化力的测定参照 QB/T 42572011 酿酒大曲通用分析方法16。酸性蛋白酶、中性蛋白酶活力的测定参照 DB 34/T3085-201
9、8 浓香大曲检测操作规程18。纤维素酶活力的测定参照 NY/T 9122020 饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法19。半纤维素酶活力的测定参照 GB/T 238742009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法20。1.3.4 数据统计与分析运用 Excel 2022 对实验数据进行统计处理,实验结果以平均值表示,并算出其标准偏差,采用 Ori-gin9.0 软件对理化指标和水解酶系实验数据进行分析。2结果与分析2.1制曲过程中高温大曲水解酶系的动态分析2.1.1液化酶和糖化酶活力的变化液化酶与糖化酶是酒曲中最为关键的酶4。其中,液化酶能催化淀粉分子内部的-1,4 型糖苷键断裂,得
10、到还原糖和糊精,为大曲中的微生物提供营养物质。糖化酶可以直接将淀粉转化为葡萄糖,进一步通过微生物利用产生酒精,糖化酶活力的高低决定白酒的出酒率21。由此可见,液化酶和糖化酶活力是判定淀粉降解能力的一项重要指标。从图 1 可知,随着制曲时间的推移,液化酶活力总体呈现先上升后下降再上升的趋势。在制曲期06 d,大曲液化酶活力迅速升高,于第 6 天达到第一次酶活峰值 0.207 g/(g h);随后 4 d 酶活下降至0.350.300.250.200.150.100.0504504003503002502001501000 2 4 6 8 10121416182022242628303234363
11、8时间/d图 1制曲过程糖化酶和液化酶活力的变化液化酶糖化酶第四期2023酿酒32袁华伟,等:高温大曲制曲过程中水解酶系及理化性质的动态变化研究*第四期20230.063 g/(g h);在制曲期 1036 d,大曲液化酶活力再次呈现持续上升的趋势,并于第 36 d 达到第二次酶活峰值 0.491 g/(g h)。糖化酶活力与液化酶活力的变化趋势大致相同,糖化酶活力呈现先下降的波浪式变化,在制曲第 2 d 达到最低值 104.605 mg/(g h),随后升高并在第 6 d 达到第一次酶活峰值 276.205 mg/(g h),在第 36 d 达到第二个酶活峰值 422.79 mg/(g h)
12、。从整个制曲过程 036 d 来看,大曲液化酶和糖化酶的活力均在第 36 d 达到最高点。2.1.2纤维素酶和半纤维素酶活力的变化纤维素酶是指可以有效的水解-1,4 型糖苷键成为纤维二糖和葡萄糖的一类酶系的总称22,23。它可以将原料中的纤维素和半纤维素转化为可发酵性糖,进而经酵母协同转化为酒精,有效提高白酒酒体量和酒糟利用率24。半纤维素酶是一种能构成植物细胞壁的多糖类水解酶,其中木聚糖酶能降解大曲中的半纤维素,加速其他酶及微生物对原料的转化,从而提高出酒率。从图 2 可知,纤维素酶与半纤维素酶活力的变化趋势同液化酶活力相似,纤维素酶活和半纤维素酶活在制曲期第 6 d 达到第一次峰值,酶活分
13、别为15.672 mg/(g h)、9.088 mg/(g h),随后 8 d 酶活分别下降至 5.056 mg/(g h)、3.139 mg/(g h);在制曲期1436 d,两者再次呈现持续上升的趋势,并于第36 d 达到第二次酶活峰值,分别为 20.461 mg/(g h)、8.559 mg/(g h)。纤维素酶活力在第 36 d 略高于第一次峰值,而半纤维素酶活力略低于第一次峰值。从酶活测定结果图来看,半纤维素酶活力总体小于纤维素酶活力。2.1.3酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力的变化蛋白酶是机体内能够有效水解蛋白质肽键产生相应的营养物质的一类酶系总称25。研究表明,在酒曲发酵过程中曲块会生
14、酸,故酸性蛋白酶在白酒发酵过程中的作用较大。蛋白酶与白酒风味物质的形成也有密切的联系26。从图 3 可知,酸性蛋白酶和中性蛋白酶的变化趋势同液化酶活力同样相似,均在第 6 天达到第一次峰值,酶活力分别为 18.595 g/(g h)、22.415 g/(g h),随后 8 d 快速下降到最低,分别为 8.555 g/(g h)、5.059 g/(g h),在制曲期 1436 d 缓慢上升至17.43 g/(g h)、20.461 g/(g h),但两种蛋白酶活力在第 36 天均低于第一次峰值。从酶活测定结果来看,不论是第 6 d 还是第 36 d,酸性蛋白酶活力均略低于中性蛋白酶活力。2.1.
15、4酯化力和发酵力的变化大曲酯化力的大小表明大曲的品质有差异。酯化作用主要受大曲中酯化酶的影响,酯化酶能够催201510500 2 4 6 8 101214161820222426283032343638时间/d纤维素酶半纤维素酶图 2制曲过程纤维素酶和半纤维素酶活力的变化25201510500 2 4 6 8 101214161820222426283032343638时间/d酸性蛋白酶中性蛋白酶图 3制曲过程酸性蛋白酶和中性蛋白酶的变化2220181614121086421.61.41.21.00.80.60.40.200 2 4 6 8 10121416182022242628303234
16、3638时间/d酯化力发酵力图 4制曲过程酯化力和发酵力的变化33化代谢大曲中的各种有机酸,使分解产物与醇反应,脱水结合成相应的酯类物质27。大曲发酵力是指大曲在发酵液中发酵,包含了一系列复杂的过程。发酵力影响着白酒的出酒率,同时发酵力也与酵母菌有关28。从图 4 可知,制曲初期,酯化力随着时间的增长呈迅速增加趋势,在第 6 d 大曲酯化力达到增长峰值 17.54 mg/(g 100h),这可能是由于微生物在适宜的环境条件下大量繁殖,形成了丰富的酶系29。随后受大曲自身发酵条件及环境因素的影响,酯化力在 68 d 有所降低,但在制曲后续阶段仍保持缓慢增长,最后趋于平缓,并在第 36 d 达到最
17、高点20.52 mg/(g 100h)。大曲发酵力在制曲 04 d 酶活力增长迅速,于第 4 d 达到第一次峰值为 1.471 g/(g 72h),随后 4 d 降低至最低为 0.286 g/(g 72h),随着制曲时间增长,发酵力于第 816 d 有所提升,且在第 16 d升高到第二次峰值为 1.180 g/(g 72h),第 1636 d 后逐渐下降。这可能是因为在制曲初始,酵母菌等微生物大量繁殖,使发酵力出现一定程度的提升,而后由于环境和大曲自身酶系的改变,酵母菌的繁殖受到抑制,大曲发酵力有所下降。随着制曲时间的增长,微生物菌群发生动态变化,发酵力会再次呈现缓慢上升的趋势30。2.2制曲
18、过程中高温大曲的理化性质2.2.1还原糖和淀粉还原糖在大曲中最主要的作用是与氨基酸发生羰氨缩合,并在一定条件下发生美拉德反应,生成白酒香气成分的前驱物质31。淀粉作为制曲工艺中监控大曲品质的重要技术指标之一,其含量变化反映微生物对淀粉的利用程度。从图 5 可知,在制曲期 012 d 前期,还原糖含量总体呈上升趋势,升高到峰值 3.385 g/100g,其后1236 d 其含量逐渐降低至最低 1.075 g/100g。这可能是由于在制曲前期微生物大量繁殖,多种水解酶不断积累,将淀粉、蛋白质等物质分解并产生大量还原糖。因此,还原糖的含量在制曲前期呈现总体上升趋势。制曲到一定的时间后,随着制曲温度的
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