非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展.pdf
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1、近年来,全球非人灵长类物种的数量正在不断地下降。根据 中国灵长类动物濒危状况评估报告 2022,我国分布的白掌长臂猿(Hylobates lar)、北白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)已经野外灭DOI:10.16605/ki.1007-7847.2022.06.0153非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展收稿日期:2022-06-02;修回日期:2022-11-11;网络首发日期:2023-06-26基金项目:福建省自然科学基金面上项目(2023J011303,2022J01423);福建省卫生健康科研人才培养项目(2019-CXB-20)作者简介:范晓静(1984),女,福
2、建三明人,硕士研究生,技师,主要从事遗传与生育调控研究;*通信作者:王心睿(1990),男,山西长治人,博士研究生,助理研究员,主要从事复杂疾病的遗传和调控机制研究,Tel:0591-87321083,E-mail:。范晓静1,2,3,魏雅岚2,3,王心睿2,3*(1.福建省儿童医院(上海儿童医学中心福建医院)医学研究中心,中国福建 福州 350011;2.福建省妇幼保健院 医学研究中心,中国福建 福州 350001;3.国家卫生健康委员会非人灵长类生育调节技术评价重点实验室(福建省妇幼保健院),中国福建 福州 350013)摘要:随着生物医学技术的发展,应用非人灵长类动物模型进行基础科学研究
3、日益广泛。与此同时,由于栖息地破坏、狩猎和基因隔离,许多非人灵长类动物濒临灭绝。因此,改进非人灵长类动物精子冻存技术对物种遗传资源的保藏具有重要的意义。本文概述了非人灵长类动物的精液特征,介绍了精液液化和冷冻精子质量评估的方法,分析了冷冻保护剂、冷冻稀释液及冷冻方法等因素对精子冻存效果的影响,总结了目前非人灵长类精子冷冻常用的冷冻保存液和冷冻方法,并对相关精子参数进行了比较,同时探讨了非人灵长类动物精子冻存研究面临的困境,并提出了可行的方案。总之,本文综述了近年来非人灵长类动物精子冻存的重要研究成果,对开发新的冷冻保护剂及改进冷冻技术具有一定的参考价值。关键词:非人灵长类动物;精液液化;精子冻
4、存;冷冻保护剂;冷冻稀释液中图分类号:Q492,Q953文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)04-0330-08Research Advances in Cryopreservation of Non-human PrimateSpermFAN Xiaojing1,2,3,WEI Yalan2,3,WANG Xinrui2,3*(1.Medical Research Center,Fujian Children s Hospital(Fujian Branch of Shanghai Children s Medical Center),Fuzhou350011,Fujian
5、,China;2.Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital,Fuzhou 350001,Fujian,China;3.NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate(Fujian Maternity andChild Health Hospital),Fuzhou 350013,Fujian,China)Abstract:With the development of bio
6、medical technology,non-human primate(NHP)models become increa-singly widely used in basic scientific research.Meanwhile,many NHP species are on the verge of extinctiondue to habitat destruction,hunting and genetic isolation.Thus,it is important to improve the sperm cryop-reservation technology to co
7、nserve the genetic resources.This review mainly described the characteristics ofNHP semen,introduced the methods of semen liquefaction and quality evaluation,and analyzed the effectsof cryoprotectants,extenders and freezing methods on sperm cryopreservation.It also compared the relevantsperm paramet
8、ers,discussed the puzzles and difficulties in sperm cryopreservation research,and proposedsome feasible solutions.In conclusion,this paper reviewed the important research results of NHP sperm cryop-reservation in recent years,which may have certain reference value for development of NHP sperm cryopr
9、o-tectants and cryopreservation technology.Key words:non-human primate;semen liquefaction;sperm cryopreservation;cryoprotectant;extender(Life Science Research,2023,27(4):330-337)第 27 卷 第 4 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援4圆园23 年 8 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡Aug.圆园23窑 经济动植物 窑第 4 期范晓静等:非人灵长类动物精子冻存技术的研究进展绝,现存 28 种灵长类物种中有
10、80%受到威胁,1518 个物种的种群数量不足 3 000 只,均属于国家二级以上保护动物。高效的精子冻存技术对于非人灵长类动物的生育繁殖和优良资源遗传基因的保存具有重要的意义。在非人灵长类动物中,食蟹猴(Macaca fascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)的精子冻存研究最为广泛;其他物种如狐猴(Lemuridae)、狨 猴(Callithrix jacchus)、松 鼠 猴(Saimiri sciureus)、非洲绿猴(Chlorocebus aethiops)、藏酋猴(Macaca thibetana)等也有精子冻存的相关报道。大量证据表明,冷冻保存会因渗透应激、
11、氧化损伤等造成精子活力丧失和功能损伤,仅极少数非人灵长类动物的冻存精子可以在人工受精后产生后代1-3。因此在精子冻存的过程中,人们常加入冷冻保护剂以提高精子复苏率4。迄今为止,使用最广泛、最成功的非人灵长类精子冷冻保护剂是含甘油的卵黄防冻液,常规方法是液氮蒸汽冷冻法。影响精子冻存效果的因素有很多,包括采精质量、冷冻保护剂的组成、冷冻方法等。本文主要就非人灵长类动物精子冻存技术的最新研究进展进行综述,以期为改进非人灵长类动物精子冷冻方法、提高精子冷冻效率提供基础资料。1非人灵长类动物的精液特征非人灵长类动物射出的精液包括液体和固体两部分,其中固体成分被称为精液凝块,它是精子沉积物和精子运输的载体
12、,并在生理上阻止其他雄性个体与同一雌性交配受精。精液凝块可以在精子和酸性阴道环境之间形成一道天然屏障,从而提高体内精子的存活率5。射精产物中精液凝块的比例存在物种间差异,但是精子总数与射精体积和凝块体积没有明显相关性6。基于凝块的比例,精液可分为 4 个等级,其中液体最多的精液为 1 级,而黏稠度最高的精液为 4 级,凝固的精液(3 级或 4 级)不会在雌性生殖道以外的条件下进行自发液化7。例如,恒河猴的精液属于 3 级,凝块致密不溶且含有 50%70%射出的精子,与液体部分分开排出8-9。此外,一些物种的精液呈轻微凝胶状且无明显凝块(狨猴,Callithrix jacchus),或凝块在排放
13、后 2030 min 可完全液化(黑猩猩,Pantroglodytes)10;部分物种不会产生精液凝块(吼猴,Alouatta caraya)11-12。对于黑手蜘蛛猴(Ateles geof-froyi)来说,精液凝块的排放还与季节有关。与雨季相比,黑手蜘蛛猴在旱季会更频繁地排出凝块,且排放的精液浓度更高,线性运动精子比例更高13。精液凝固-液化转变的过程主要由精液凝固蛋白(semenogelin,Sg)、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)及附睾蛋白酶抑制剂(epidi-dymal protease inhibitors,Eppin)等共同作用调控
14、。射精后,Sg玉蛋白特异性结合 Eppin 蛋白,并与Sg域及纤维结合蛋白共价交联形成网状结构,以抑制精子的运动。随后,Sg玉与 Zn2+结合激活PSA,促进精液液化。凝固因子和液化因子协调作用,促使精液先后发生凝固与液化两个变化过程。一旦这种协调关系被打破,精液就会发生液化异常。当机体发生前列腺炎或生殖道感染时,前列腺液中蛋白水解酶的含量或活性下降,导致精液不液化14。大多数非人灵长类动物射出的精液凝块不会自然液化,很可能是因为 PSA 缺乏或 Sg玉发生了糖基化修饰15。利用基因组、转录组、蛋白质组等多组学技术比较人类与非人灵长类精液的不同之处,极有可能发现液化异常的机制,由此开发相应的方
15、法进行精液凝块液化处理,有利于辅助生殖技术在非人灵长类动物的应用。2冷冻前精液的液化常用的猕猴精液液化方法是将精液采集到含有 TALP-Hepes 洗精液的试管中,采用 37 益进行孵育4,16-17。随后对液化精液进行离心,收集的精子沉淀即可用于冷冻保存。TES-Tris 缓冲液和椰子水可用于新热带区灵长类的精液液化。研究证实,在卷尾猴(Cebus apella)精液中加入 TES-Tris缓冲液或椰子水溶液后,采用 35 益进行孵育并辅助机械吹打,可促使凝块完全液化形成黏性液体,但冷冻后复苏精子的存活率和活力等参数显著下降18。近期研究发现,在松鼠猴精液中以等比例加入 ACP-118誖 溶
16、液,结合 37 益孵育,可以促进凝块溶解,并释放出精子19。对于倭黑猩猩(Pan pa-niscus)来说,凝块排放后直接孵育会使液化需要更长的时间(24 h),但超过 1 h 的孵育会对精子质量产生有害影响20。当前,针对非人灵长类精液凝块处理的研究较少,可能是因为电刺激采精辅助常规处理就可以获得足够的精子数量。然而,当射精的精子总量较低时,凝块处理方式成为提高游离精子数量的关键环节。根据凝块形成机制,可以通331生命科学研究圆园23 年过增加液化因子如胰蛋白酶促进精液液化。尽管添加胰蛋白酶会增加精子损伤的数量,但也增加了活动精子的总数量21。为减少液化带来的损伤,一方面可以调整酶的浓度和作
17、用时间,另一方面可以对胰蛋白酶进行化学修饰或寻找其他新的酶制剂。3精子冷冻的影响因素3.1冷冻保护剂在精子冷冻过程中,添加冷冻保护剂可以显著降低细胞死亡率。根据能否自由通过细胞膜,冷冻保护剂可分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂包括甘油、二甲亚砜、乙二醇、丙二醇等;非渗透性冷冻保护剂包括卵黄、糖类、脂蛋白等物质,其作用是通过维持细胞膜的稳定来保护精子22。渗透性冷冻保护剂有助于降低溶液的冰点,通过替换细胞内的水来减少渗透性休克,并降低细胞内冰晶的形成。但是,高浓度的渗透性冷冻保护剂会因化学毒性对细胞造成损害23。因此,合适的冷冻保护剂浓度是冷冻保存成功的关键因素。研究表明
18、,5%甘油适用于恒河猴和食蟹猴精子的冷冻保存,复苏后精子活力最高24-25。近期,一项关于婆罗洲猩猩(Pongo pyg-maeus morio)精子冷冻的研究发现,含 6%甘油的TEST 稀释液可以取得良好的冻存效果26。不同的冷冻保护剂对不同物种精子的冷冻保存效果也不同,这与冷冻保护剂在精子细胞中的渗透系数有关。对于食蟹猴精子来说,乙二醇和甘油的冷冻保存效果最好,二甲亚砜和乙酰胺次之,丙二醇最差27。乙二醇对恒河猴精子细胞的渗透系数高于水、二甲亚砜、甘油、丙二醇,被认为是最合适的恒河猴精子冷冻保护剂28。为避免冷冻保护剂与精子接触的时间过长而对其造成伤害,可以采用二次稀释法。研究报道,第一
19、次稀释精液于 25 益平衡后再进行第二次稀释,之后快速冷却,有助于提高精子活力,适合于日本猕猴(Macaca fuscata)精子的冷冻保存29。3.2冷冻稀释液冷冻稀释液是精子冷冻的介质,主要包括两性离子、柠檬酸盐、糖、三羟甲基氨基甲烷(trihy-droxymethyl aminomethane,Tris)、Tris 乙磺酸(TES)等成分。非人灵长类常用的冷冻稀释液为 TTE 和TEST,稀释液的物理性质和组成成分直接影响精子的冷冻成活率22。3.2.1渗透压渗透压对精子的冷冻效果影响很大,渗透应激会导致精子发生氧化应激,促使脂质过氧化,从而显著降低精子活力30。食蟹猴精子可以耐受344
20、425 mOsm/kg 渗透压,渗透压在此范围内的TTE、DM、mDM、LG-DM、G-DM、TCG均适用于食蟹猴精子的冷冻保存27。恒河猴精子在75900 mOsm/kg渗透压内表现出线性渗透反应,精子存活率跃80%,精子活力和膜完整性对高渗透压更敏感4。TEST因高渗毒害作用不适合食蟹猴和恒河猴精子的冷冻保存31。3.2.2卵黄卵黄中含有许多未被明确定义的化合物,其中低密度脂蛋白被认为对精子具有冷冻保护作用,具体机制尚不明确32。在非人灵长类动物中,几乎所有成功的精子冷冻保存都需要添加卵黄,甚至在没有渗透性冷冻保护剂的情况下,单独使用卵黄也能够保护射精和附睾精子,使其免受精子冻融过程产生的
21、损伤33。研究证实卵黄具有重要的抗氧化作用,有观点认为卵黄中的低密度脂蛋白通过结合细胞膜防止脂质过氧化34。卵黄的保护具有剂量依赖性,在恒河猴精子的快速冷冻过程中,含 20%卵黄的 TEST 防冻液的效果最好,当卵黄含量超过 40%时,精子活力反而下降35。需要指出的是,卵黄来源于动物,有可能受到微生物的污染,具有将病原体引入冷冻保存精子样本的风险。因此,卵黄替代物如不饱和脂质,或商业化无卵黄稀释液如 SC 培养基(SpermCryo All-round),成为另一种选择32,36。3.2.3抗氧化剂冷冻不仅会给细胞带来渗透压力,还会对精子造成氧化损伤,补充抗氧化剂可减轻冷冻带来的氧化应激30
22、。抗氧化剂通常可分为酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂。酶抗氧化剂包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。非酶抗氧化剂包括维生素 C、维生素 E、谷胱甘肽、半胱氨酸、牛磺酸等。抗氧化剂的类型和剂量对解冻后精子的质量有很大影响。研究显示,在冷冻保护剂中添加维生素 C、谷胱甘肽对解冻后精子的存活率没有显著影响,但是添加 10 mmol/L维生素 E 可以显著提高解冻后精子的存活率37。2011 年,McCarthy 等34首次证明,恒河猴精子的冷冻保存会诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)显著增加;补充抗氧化剂如超氧化物歧化酶、过332第 4 期氧
23、化氢酶、琢-生育酚等可显著降低 ROS 诱导的膜损伤程度。另有研究报道,在卷尾猴精子冷冻液中添加 50 滋g/mL 过氧化氢酶可以减少精子膜脂质过氧化,保持精子质膜的完整性38。3.2.4糖一些精子冷冻剂含有糖成分,糖类可以提供能量,维持渗透压,保护精子使其免受冷冻损伤。糖的类型对冷冻精子的质量参数有显著影响。对于非人灵长类动物的精子保存,最广泛使用的是葡萄糖、乳糖和棉子糖。与棉子糖(三糖)相比,葡萄糖(单糖)和乳糖(双糖)在保护精子活力、质膜功能和顶体完整性方面更有效39。在适当的浓度下单糖和双糖组合可以显著改善冷冻保存的哺乳动物精子质量40-41,例如:含有多种糖成分的 TTE 防冻液的冷
24、冻保存效果明显好于仅含单一糖成分的TEST 防冻液42。除了乳糖外,另一种双糖海藻糖也常被用于精子冷冻保存。海藻糖可以显著降低冷冻保存精子细胞内钙、环磷酸腺苷水平,导致蛋白质酪氨酸磷酸化减少,添加 50 mmol/L 或100 mmol/L 海藻糖可抑制精子的顶体反应,提高其冷冻存活率43。此外,羟丙基纤维素作为一种长度可变的多糖,其物理性质类似于人血清白蛋白,可在低温下形成黏性凝胶,具有很高的防冻性能,已被成功应用到人类精子的冷冻保存中44。3.2.5氨基酸氨基酸对精子有一定的冷冻保护作用,并且不同的氨基酸有不同的最佳浓度。在 TTE 防冻液中分别添加 5 mmol/L 脯氨酸、10 mmo
25、l/L 谷氨酰胺以及 10 mmol/L 或 20 mmol/L 甘氨酸可显著改善解冻后食蟹猴精子的活力以及膜和顶体的完整性;然而,当氨基酸浓度分别增加到脯氨酸和谷氨酰胺为 60 mmol/L、甘氨酸为 80 mmol/L 时,精子的活力以及膜和顶体的完整性显著下降45。Feng等46首次证明,脯氨酸脱氢酶(proline dehydroge-nase,PRODH)定位于顶体和精子尾部的中间部分,脯氨酸通过 PRODH 介导的代谢和吡咯烷的胺结构保护精子,使其免受氧化应激,因此在冷冻保护剂中添加一定浓度的脯氨酸有助于提高精子质量。谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸参与谷胱甘肽合成,可以作为抗氧化剂对抗
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