低次烟叶浸膏的提取及其抗氧化活性.pdf
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1、收稿日期:.基金项目:国家自然科学基金青年项目();中央引导地方科技科技创新基地建设项目(Z D D )作者简介:刘欢(),男,教授,博士.E m a i l:l i u_h u a n h o t m a i l c o m.刘欢,何熙芳,饶超奇,等低次烟叶浸膏的提取及其抗氧化活性J南昌大学学报(理科版),():L I U H,HEXF,R AOCQ,e t a l E x t r a c t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f l o w g r a d et o b a c c ol e a fe x t r a c tJJ
2、 o u r n a lo fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),():低次烟叶浸膏的提取及其抗氧化活性刘欢,何熙芳,饶超奇,陈栋,邵灯寅,罗海涛(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 ;江西中烟工业有限责任公司,江西 南昌 )摘要:采用乙醇提取法、酶法、索氏提取法从低次烟叶中制备浸膏,首先通过气相色谱质谱联用(G CM S)分析了种方法提取得到的浸膏中挥发性成分差异;其次通过测定D P P H、A B T S、铁离子还原能力个抗氧化指标来评估其体外抗氧化活性;并通过相关性分析研究了低次烟叶浸
3、膏中的抗氧化活性与总酚、总黄酮、总糖含量的相关性;最后将种方法提取得到的浸膏添加在卷烟中进行感官评价.结果表明,种提取方法中酶法得率最高;经G CM S分析,种浸膏共检出了 种组分;种浸膏均表现出体外抗氧化活性,醇提浸膏的清除效果最佳;在总酚、总黄酮、总糖的测定中,醇提浸膏中的含量更高;通过相关性分析发现,酚类和黄酮类的含量与抗氧化活性有密切关系;种浸膏对卷烟都有明显的增甜增香和降低刺激性的效果.关键词:低次烟叶;浸膏;提取方法;气相色谱质谱法(G CM S);抗氧化活性中图分类号:O 文献标志码:A文章编号:()E x t r a c t i o na n da n t i o x i d
4、a n t a c t i v i t yo f l o w g r a d e t o b a c c o l e a f e x t r a c tL I U H u a n,HEX i f a n g,R AOC h a o q i,CHE ND o n g,S HAOD e n g y i n,L UO H a i t a o(S t a t eK e yL a b o r a t o r yo fF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g
5、 ,C h i n a;T o b a c c oJ i a n g x i I n d u s t r i a lC o,L t d,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i sw o r k,e x t r a c t sw e r ep r e p a r e d f r o ml o w g r a d e t o b a c c o l e a v e sb yu s i n ge t h a n o l e x t r a c t i o n,e n z y m a t i cm e t h o da n dS o x
6、h l e t e x t r a c t i o n F i r s t l y,t h ed i f f e r e n c e so f v o l a t i l e c o m p o n e n t s f r o mt h e e x t r a c t sb y t h e s e t h r e em e t h o d sw e r e a n a l y z e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y(G CM S)S e c o n d l y,t h r e ea n t
7、i o x i d a n t i n d e x e s,D P P H,A B T Sa n df e r r i cr e d u c t i o nc a p a c i t y,w e r em e a s u r e dt oe v a l u a t e t h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t y i nv i t r o T h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t yo f t h ee x t r a c t s f r
8、 o ml o w g r a d e t o b a c c oa n dt h ec o n t e n t so f t o t a l p h e n o l s,t o t a l f l a v o n o i d s,a n dt o t a l s u g a r sw e r es t u d i e db yc o r r e l a t i o na n a l y s i s F i n a l l y,t h ee x t r a c t sw e r ea d d e dt ot h ec i g a r e t t e f o r s e n s o r ye v
9、 a l u a t i o n T h er e s u l t ss h o w e dt h a te n z y m a t i cm e t h o dh a dt h eh i g h e s ty i e l da m o n gt h e t h r e ee x t r a c t i o nm e t h o d s B yG CM Sa n a l y s i s,a t o t a l o f c o m p o n e n t sw e r ed e t e c t e d i nt h e t h r e ee x t r a c t s A l l t h e t
10、 h r e ee x t r a c t ss h o w e da n t i o x i d a n t a c t i v i t y i nv i t r o,a n dt h ee t h a n o l e x t r a c t sh a dt h eb e s ts c a v e n g i n ge f f e c t T h ea l c o h o l e x t r a c th a dh i g h e r c o n t e n t so f t o t a lp h e n o l s,t o t a l f l a v o n o i d s,a n dt
11、o t a l s u g a r s T h ec o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ec o n t e n t so fp h e n o l sa n d f l a v o n o i d sw e r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h ea n t i o x i d a n t a c t i v i t y T h r e ek i n d so f e x t r a c t sh a v eo b v i o u se f f e c t o fs w e e
12、t e n i n ga n dr e d u c i n gt h e i r r i t a n t K e yW o r d s:L o w g r a d eT o b a c c oL e a f;e x t r a c t s;e x t r a c t i o nm e t h o d s;g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y;a n t i o x i d a n t a c t i v i t y烟草是一种特殊的经济作物,它的种植和产品加工与中国经济社会发展息息相关,优质烟叶一般作为
13、原料制作成香烟等烟草制品,而一些品质较低、存放时间过长等不适于卷烟生产的低次烟叶则作为废弃物被焚烧或者掩埋,既造成了资源浪费,也造成了环境污染.烟草浸膏是一种具有浓郁烟草香气的深棕色黏稠膏体,不仅可以应用于烟草制品的加香加料,能够增香除杂,提升卷烟的抽吸品质;烟草浸膏中还含有许多有益的活性物质,如多酚、黄酮、多糖等,第 卷第期 年月南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e)V o l N o J u n 具有优越的抗氧化活性和抗菌性.近年来我国关于烟草浸膏的
14、研究主要集中在制备工艺优化和香味成分,鲜有报道对不同提取方法得到的浸膏性质进行对比研究.目前一些新型提取技术的兴起虽然使得烟草 浸 膏 的 制 备 更 加 环 保 高 效,如 分 子 蒸 馏 技术、微波辅助提取法、超临界流体萃取等方法,但是投资规模小、运行成本高、操作难度系数大.各种提取方法中,乙醇提取法是将植物原料与乙醇按照一定的比例置于烧瓶中加热回流一段时间后过滤浓缩得到浸膏产品,是一种简单传统的提取方法,它的优点是设备操作简单,成本较低.索氏提取法能够实现溶剂的连续回流和动态提取,同时使每次通过提取原料的溶剂都是经冷凝回流的新溶剂,大大简化了实验操作,可以较大限度保持原料本身的香味.酶法
15、 利用特定的酶水解植物的细胞壁或是将蛋白质、多糖等大分子物质酶解成氨基酸、还原糖等小分子物质,达到提高植物提取物得率和香气成分含量的目的.烟草中含有许多具有抗氧化活性的生物活性物质.S a a d 等人研究了烟草根部提取物的抗氧化性,发现正己烷提取物、甲醇提取物、乙醇提取物都对D P P H自由基有明显的清除作用.R u等人发现烟草中黄酮类物质对超氧阴离子、A B T S和D P P H自由基表现出超强的清除能力.李莹 采用超声辅助水蒸馏法提取废弃烟叶中的水溶性多糖,发现烟叶水溶性多糖对羟自由基和A B T S自由基的清除能力较强.但目前关于烟草浸膏的抗氧化活性和其总酚总黄酮总糖含量的相关性有
16、待进一步考察.有研究表明,提取物的基本理化性质、抗氧化活性与提取方法密切相关,不同的提取方法得到的提取物的生物活性可能存在较大的差异.本研究以低次烟叶为原料,采用乙醇提取法、酶法和索氏提取法制备烟草浸膏,综合考察比较了种方法对烟草浸膏的得率、基本理化性质、挥发性香味成分以及抗氧化活性的影响,为低次烟叶的综合利用、烟草浸膏作为天然抗氧化剂的开发提供数据参考.材料与方法材料与仪器材料与试剂低次烟叶:样烟Y L ,赣州卷烟厂;单料烟样品烟丝:江西中烟工业有限责任公司;c m双圈定性滤纸:杭州通用电气生物科技有限公司;无水乙醇、正己烷:色谱级、硫酸、柠檬酸钠、葡萄糖标准品、三氯化铁、无水乙酸钠、冰醋酸
17、、无水乙醇、甲醇、七水合硫酸亚铁、氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化铝、无水碳酸钠:分析纯,西陇科学股份有限公司;果胶酶(万Ug)、耐 高 温 淀 粉 酶(万Um g)、正构烷烃、A B T S:阿拉丁试剂有限责任公司;酸性蛋白酶(万Ug):上海麦克林生化科技有限公司;无水硫酸钠、柠檬酸、福林酚试剂、,三吡啶基三嗪(T P T Z)、没食子酸标准品、芦丁标准品:索莱宝生物科技有限公司;D P P H:梯希爱上海化成工业发展有限公司.仪器与设备电热恒温水浴锅:HWS,江西鼎技科学仪器有限公司;电热鼓风干燥箱:DHG A,上海一恒科学仪器有限公司;g摇摆式高速粉碎机:D F Y C,温岭市林大机械有限公司;
18、旋转蒸发仪:K E AA,上海亚荣生化仪器厂;循环水真空泵:S H Z I I I,上海亚荣生化仪器厂;气相色谱三 重 串 接 四 极 杆 质 谱 联 用 仪:A g i l e n t A,美国安捷伦科技有限公司;紫外可见分光光度计:UT,屹谱仪器制造有限公司;冰柜:B D/B C E,浙江星星冷链集成股份有限公司;电子天平:L E E,上海梅特勒托利多仪器公司;梅特勒台式折光仪:RM /R X ()R ,上海梅特勒托利多仪器公司;旋涡振荡器:VO R T E X,艾卡(广州)仪器设备有限公司.烟草浸膏的制备原料预处理将低次烟叶置于 的烘箱中烘干水分,将干燥后的烟叶磨粉,过 目筛备用.乙醇提
19、取法称取 g烟叶粉末,加入到 m L烧瓶中,再加入 m L浓度为 的乙醇,将烧瓶置于恒温水浴锅中以 加热回流h,减压过滤,将滤液置于旋转蒸发仪中完全蒸发乙醇后计算烟草浸膏得率.酶法准确称取 g过筛后的烟草样品,加入 m L蒸馏水,用m o lL柠檬酸钠和m o lL柠檬酸调节p H至,加入适量酶(淀粉酶:果胶酶:酸性蛋白酶,添加量为),于、rm i n摇床h,水浴h,灭酶,用m o lLHS O调p H至,离心,取上清液,旋蒸,加倍乙醇复溶,沉淀后离心,取上清液,南昌大学学报(理科版)年再次旋蒸至样品呈浓稠状态,得烟草浸膏并计算得率.索氏提取法准确称取份烟叶粉末样品 g于滤纸筒中,将滤纸筒装进
20、索氏提取器的浸提筒内,在 m L的平底烧瓶中加入 m L正己烷,恒温水浴加热,提取h后,收集正己烷于圆底烧瓶中,置于旋转蒸发仪上蒸发掉多余的溶剂,称其总质量,计算得率.烟草浸膏的得率计算浸膏得率旋蒸之后的烧瓶和浸膏的质量/g 烧瓶的质量/g加入的烟末质量/g 烟草浸膏的基本理化性质测定酸值参考G B/T 香料酸值或含酸量的测定 测定;折光系数参考G B/T 香料折光系数的测定 测定;砷含量参考G B/T 食品添加剂中砷含量的测定 测 定;相 对 密 度 参 考G B/T 香料相对密度的测定 测定.烟草浸膏的G CM S分析进样方式采用顶空固相微萃取(H SS PME)的进样方式,具体操作为:称
21、取g样品于 m L螺口玻璃样品瓶中,聚四氟乙烯隔垫密封,水浴加热 m i n,插入固相微萃取纤维头,萃取 m i n,将萃取头插入G CM S进样口,解析m i n后进样.气相色谱条件色谱柱为H P M S色谱柱(m mm m);进样口温度:;升温程序:柱温,保持m i n,以m i n升到 ,保持m i n,最后以m i n升至 ,保持 m i n;载气:氦气;流量m Lm i n;进样方式:分流进样,分流比,进样体积:L.质谱条件E I源,离子源温度:,电离电压 e V,三重四级杆质谱仪以全扫描模式运行,溶剂延迟m i n,质量采集范围 mz.保留指数按照同样的升温程序将正构烷烃作为标准品
22、进行进样处理,根据正构烷烃的保留时间和样品挥发性成分的保留时间计算得出保留指数.保留指数按下式计算:R I n ttntn tn式中,R I为保留指数(r e t e n t i o ni n d e x,又称K o v a t s指数);n为正构烷烃的碳原子数;t为香气成分的保留时间;tn为晚于香气成分流出的正构烷烃的保留时间;tn为早于香气成分流出的正构烷烃的保留时间.抗氧化活性测定D P P H自由基清除作用参考S AG D I C 和S HA RMA 等的方法并稍作修改,将m L浸膏无水乙醇稀释液用移液枪转移到 m L离心管中,再移取mm o lL的D P P H反应液m L,涡旋后在
23、阴暗条件下反应 m i n,测得混合液在 n m下的吸光值A,无水乙醇代替浸膏样品测得A,无水乙醇代替D P P H反应液测得A,用无水乙醇作调零,以抗坏血酸(V c)作为阳性对照,重复次平行实验.清除率按下式计算:RA(AA)A 式中:R为清除率();A为空白吸光值;A为样品吸光度;A为无水乙醇代替D P P H反应液所得吸光值.A B T S自由基清除作用参考E NNA J A R 和T A B A R T 等人的方法并稍作修改:以蒸馏水为溶剂,用 m L容量瓶一一 配 制 好 mm o lL过 硫 酸 钾 溶 液 与mm o lLA B T S溶液后混合在烧杯里,避光保存 h后即得A B
24、 T S储备液,然后用无水乙醇将其稀释成 n m下O D值为 的淡绿色的A B T S工作液.将m L浸膏无水乙醇稀释液与m L上述工作液在m L离心管中混合后于阴暗条件下反应 m i n,在 n m处测定吸光值A,无水乙醇代 替浸膏样品 测得A,无 水乙醇 代 替A B T S工作液测得A,用无水乙醇调零,以V c作为阳性对照,重复次平行实验.清除率按下式计算:RA(AA)A 式中:R为清除率();A为空白吸光值;A为样品吸光度;A为无水乙醇代替A B T S工作液所得吸光值.F R A P法测定抗氧化能力参考WOOT TONB E A R D 文献中的方法并稍作修改.将p H为的m o l
25、L乙酸第期刘欢等:低次烟叶浸膏的提取及其抗氧化活性乙酸钠缓冲溶液、mm o lL,三吡啶基三嗪(T P T Z)溶液和 mm o lLF e C l溶液按 的体积比配制成F R A P工作液,现用现配.再取 m gT P T Z,用 mm o lL盐酸定容到 m L,得到T P T Z盐酸溶液.分别取 m L的mm o lLF e S O溶液,加入m LF R A P工作液和m L的蒸馏水,在 下水浴保温 m i n,在 n m处测定吸光度,绘制标准曲线,求得回归方程y x (R ).分别取 m L浸膏乙醇溶液(、m gm L),同法处理,用无水乙醇调零,测定吸光度.以V c作为阳性对照,浸膏
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- 烟叶 浸膏 提取 及其 氧化 活性
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