创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析.pdf
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1、为研究斜带石斑鱼致病菌VV106的生物学特性,对其进行菌株鉴定、理化因素对生长的影响和药敏性分析.结果表明:VV106为创伤弧菌,具有典型的海洋细菌特征,最适生长温度为30、氯化钠浓度为3%、pH值为8.创伤弧菌VV106对硫酸新霉素、氨苄青霉素、磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和多西环素耐药,对甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸卡那霉素、恩诺沙星、盐酸土霉素、磺胺二甲氧嘧啶和交沙霉素敏感.在1/2 MIC氟苯尼考、恩诺沙星和交沙霉素条件下分别诱导获得了Flo20、Enr20和Jos20,它们不仅具有稳定可遗传的耐药性,而且交叉耐药比率分别为75%、50%和62.5%.本研究可为防治创伤弧菌引起的疾病、指导精准
2、用药、提高水产养殖经济效益奠定基础.关键词:创伤弧菌;菌种鉴定;药敏性;生物学特性中图分类号:S917.1 文献标志码:A 文章编号:2095-7122(2023)02-0101-09Identification and biological characteristics of Vibrio vulnificus VV106ZHANG Danfeng,ZHU Qiuqiang,HU Yuanqing,ZHU Dining,WU Cai(School of Biological Science and Biotechnology,Zhangzhou,Fujian 363000,China)Ab
3、stract:In order to study the biological characteristics of the pathogenic bacteria VV106 from Epinephelus coioides,identification of strain,the influence of physical and chemical factors on the growth and analysis of drug susceptibility were carried out.The results showed that VV106 was identified a
4、s Vibrio vulnificus and had typical characteristics of marine bacteria.The optimum growth temperature was 30,the optimum growth sodium chloride concentration was 3%,and the optimum growth pH was 8.Vibro vulnificus VV106 was resistant to neomycin sulfate,ampicillin,sulfadiazine,sulfamonomethoxine and
5、 doxycycline,but sensitive to thiamphenicol,florfenicol,kanamycin sulfate,enrofloxacin,oxytetracycline hydrochloride,sulfadimethoxine and josamycin.Flo20,Enr20 and Jos20 were induced under the conditions of 1/2 MIC of florfenicol,enrofloxacin and josamycin,respectively.They not only had stable and h
6、eritable drug resistance,but also had cross-resistance rates of 75%,50%and 62.5%,respectively.This study can lay a foundation for preventing and treating diseases caused by Vibrio vulnificus,guiding precise medication,and improving the economic benefits of aquaculture.Key words:Vibrio vulnificus;ide
7、ntification of strain;drug susceptibility;biological characteristics创伤弧菌(Vibrio vulnificus)属于弧菌科弧菌属,革兰氏阴性细菌,有极端单鞭毛,在选择性硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar,TCBS)上呈绿色菌落.它是一种致命的人类条件致病菌,临床症状主要表现为坏死性筋膜炎、败血病、脓毒症和严重的创口感染等1-2,这是一种重要的水生环境和水产品污染病原菌,可使许多种经济动物患病,包括石斑鱼3.漳州是“中国石斑鱼之都”,主要
8、的养殖品种有斜带石斑、云龙石斑、虎龙杂交斑、青石斑、老虎斑等近20种,收稿日期:2023-02-01基金项目:福建省自然科学基金项目(2020J01809,2021J01995);福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JAT190358)作者简介:张丹凤(1979),女,福建泉州人,博士,教授.2023年闽南师范大学学报(自然科学版)已经形成从种苗繁育、养殖到销售完整的产业链4.2021年,漳州石斑鱼养殖面积 2333.3公顷,养殖产量 17 900 t,产值 22.1亿元,位列全国第一.虽然斜带石斑鱼是漳州主要的石斑鱼养殖品种之一,但是目前还没有关于斜带石斑鱼源创伤弧菌及其生物学特性的相关报道
9、.本论文重点对斜带石斑鱼源创伤弧菌VV106进行菌株鉴定、理化因素对其生长的影响和药敏性分析,旨在为水产健康养殖提供理论依据.1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 菌株从行动迟缓、体表局部出血、鳍基部发炎的斜带石斑鱼肾脏中分离纯化得到的优势菌株VV106.1.1.2 培养基TCBS培养基:5 g酵母浸粉、10 g蛋白胨、10 g硫代硫酸钠、10 g枸橼酸钠、5 g牛胆粉、3 g牛胆酸钠、20 g蔗糖、10 g氯化钠、1 g柠檬酸铁、0.04 g溴麝香草酚兰、15 g琼脂,1 L蒸馏水,pH值为8.6 0.1.LB培养基(Luria-Bertani,LB):10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物
10、、10 g氯化钠,1 L蒸馏水,pH值为7.0.LB琼脂培养基在上述配方中加入15 g 琼脂.MH肉汤培养基(mueller-hinton broth,MB):2 g牛肉粉、1.5 g可溶性淀粉、17.5 g酸水解酪蛋白,1 L蒸馏水,pH值为7.4 0.2.1.1.3 主要试剂Premix Taq、DL2,000 DNA Marker等采购自宝日医生物技术(北京)有限公司.盐酸、氢氧化钠、氯化钠等购自国药集团化学试剂有限公司.引物和12种常用渔业抗菌药物:甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、恩诺沙星、氨苄青霉素、盐酸土霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、交沙霉素和多西环
11、素,购自生工生物工程(上海)股份有限公司.1.2 实验方法1.2.1 斜带石斑鱼致病菌的分离对采集的斜带石斑鱼低温保存运送至实验室,用酒精棉擦拭石斑鱼体表,接种环蘸取石斑鱼肾脏组织,于TCBS培养基上平板划线,30 培养18 h后,挑取绿色优势单菌落VV106进行进一步的分离纯化.1.2.2 16S rRNA基因鉴定采用煮沸裂解法提取 VV106基因组 DNA,并利用正向引物 27F:5-AGA GTT TGA TC(C/A)TGG CTC AG-3,和反向引物1492R:5-GG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3,进行16S rRNA基因扩增.根据电泳结果,将目的条带大小约1
12、.5 kbp的PCR产物送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序,并将测序结果进行BLAST分析.1.2.3 理化因素对VV106生长的影响为了了解不同理化因素对VV106生长特性的影响,将VV106接种于氯化钠浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的LB琼脂培养基上、pH值分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12的LB琼脂培养基上,每个浓度重复3次,30 培养24 h后观察VV106的生长情况,以此来确定VV106的生长氯化钠浓度范围和pH值范围.根据 VV106 生长的氯化钠浓度范围和 pH 值范围,配置相应的 LB 培养基,接种对数生长期VV106至波长 600 n
13、m 处吸光值(absorbance,A)为 0.02,30、220 r/min 振荡培养 4 h 后测定 A600,每个102张丹凤,等:创伤弧菌VV106的分离鉴定及其生物学特性分析第2期浓度重复 3次.以不同盐浓度或pH值为横坐标、A600为纵坐标绘制生长曲线,判断VV106生长的最佳氯化钠浓度或pH值.为了进一步了解VV106的生长温度范围,接种VV106至LB琼脂培养基,分别置于20、25、30、35、40、45、50、55 下培养 24 h.在此基础上,对其进行 LB 液体培养,使其起始 A600为 0.02,在不同温度下、220 r/min振荡培养4 h,每个温度重复3次.以不同温
14、度为横坐标、A600为纵坐标绘制温度生长曲线,分析VV106在不同温度下的生长情况.1.2.4 VV106药敏性的检测采用二倍稀释法测定药敏性,以创伤弧菌 ATCC27562 作为对照.首先在 96 孔板的第 1 列中加入200 L 含 200 g/mL 抗菌药物的 MHB,紧接着在第 210 列内加入 100 L MHB,第 11 列孔内加入200 L MHB 作为空白对照.从第 1 列中吸取 100 L 抗菌药物到第 2 列中,反复吹吸均匀,再移取100 L至第3列中,依次稀释到第10列.吸取对数生长期VV106稀释至A600为0.02的菌液100 L,分别加入到第 1 列至 10 列的孔
15、中,第 12 列孔中加入 200 L 的稀释菌液作阳性对照.每种抗菌药物重复 3次.30 培养24 h,利用全波长酶标仪进行测定,确定不同抗菌药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC).1.2.5 VV106传代诱导选取3种VV106敏感的抗菌药物:氟苯尼考、恩诺沙星和交沙霉素,分别在它们1/2 MIC条件下对VV106进行传代培养,每代培养12 h,连续传代20代,将获得的第20代菌株分别命名为Flo20、Enr20、Jos20.同时将VV106在未添加任何抗菌药物的LB培养基中同步传代20代,第20代菌株命名为VV106-20.按照1.2
16、.4的方法,对每代传代菌株进行相应抗菌药物MIC测定,观察它们MIC是否发生变化.如果VV106-20 MIC未发生变化、且诱导后菌株MIC与原始出发菌株VV106 MIC比值大于等于4倍的话,则诱导菌株产生了耐药性.为了验证Flo20、Enr20和Jos20耐药性的稳定性,在未添加抗菌药物的LB琼脂培养基上进行平板划线,连续划线10次,分别将它们的第10代菌株进行相应抗菌药物的MIC测定,并与原始Flo20、Enr20、Jos20的MIC进行比较,以此判断耐药性的遗传稳定性.1.2.6 传代菌株交叉耐药性的测定培养 Flo20、Enr20和 Jos20至对数生长期,按照 1.2.4的方法对除
17、了磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、多西环素外的 9种抗菌药物进行 MIC测定和交叉耐药的判定.交叉耐药的标准为药物诱导后菌株对非诱导药物的 MIC比诱导前升高至少 4倍.参照张凯等5的方法分析交叉耐药比率,比较它们的交叉耐药程度.2 实验结果与分析2.1 VV106病原菌株鉴定将斜带石斑鱼肾脏样品接种于TCBS上,由图1可见,在TCBS培养基上的菌落颜色为有黄色和绿色.因为创伤弧菌在TCBS培养基上为绿色,所以挑取绿色的优势单菌落,进行平板划线获得纯化的单菌落VV106.利用27F引物和1492R引物对VV106进行16S rRNA基因PCR扩增,如图2所示,在1.5 kbp处出现了目的条带.目的条
18、带测序结果在NCBI上进行BLAST比对,与其同源性最高的为创伤弧菌,相似性高达99.96%.因此,判断VV106为创伤弧菌.1032023年闽南师范大学学报(自然科学版)2.2 理化因素对VV106生长的影响2.2.1 氯化钠浓度创伤弧菌VV106在氯化钠质量分数为1%8%的LB琼脂培养基上培养24 h后,发现它生长的氯化钠浓度范围为1%6%,但在6%条件下,只有少数几个小菌落生长.在含1%6%氯化钠LB液体培养基中培养4 h(见图3),氯化钠质量分数为3%,VV106生长情况最好;VV106在6%氯化钠的LB中培养4 h还未见生长,可能是因为培养时间较短和6%氯化钠质量分数太高引起的,当培
19、养时间延长至8 h,其吸光值为0.112,说明VV106在6%氯化钠浓度条件下生长相对缓慢,与LB琼脂结果相一致.根据最佳生长氯化钠质量分数可以看出,VV106为弱嗜盐菌.图1 斜带石斑鱼肾脏分离的菌落Fig.1 Colonies isolated from kidney of Epinephelus coioides注:M为DNA marker DL2 000;1为16S rRNA基因PCR扩增产物.图2 16S rRNA基因PCR扩增产物Fig.2 PCR product of 16S rRNA gene图3 氯化钠质量分数对创伤弧菌VV106生长的影响Fig.3 The effect o
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