丹酚酸B对小鼠脑出血的神经保护作用研究.pdf
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1、神经损伤与功能重建2023年8月第18卷第8期论著丹酚酸B对小鼠脑出血的神经保护作用研究木艳玲1,2,刘扬1,2,李媛1,2,薛孟周1,2作者单位1.郑州大学第二附属医院脑血管病科郑州 4500012.郑州大学医学科学院郑州 450001基金项目国家自然科学基金项目(No.8207052870);国家自然科学基金重点国际(地区)合作研究项目(No.81520108011);国家重点研发计划项目(No.2018YFC1312200)收稿日期2022-05-18通讯作者薛孟周摘要目的:探讨丹酚酸B(SalB)对小鼠脑出血(ICH)的神经保护作用及机制。方法:C57BL/6J雄性小鼠108只随机分为
2、Sham组,ICH+Vehicle组,ICH+SalB组,每组36只。型胶原酶制备ICH模型,ICH+SalB组术后2 h尾静脉注射SalB 30 mg/kg,Sham组和ICH+Vehicle组尾静脉注射等量生理盐水,连续3 d。术后第3天,采用mNSS和转角实验观察行为学指标;HE染色观察脑组织损伤情况;脑含水量检测评估脑组织水肿;伊文思蓝(EB)外渗试验评估血脑屏障渗透性;Western blot检测ZO-1和Occludin蛋白表达水平评估血脑屏障完整性,检测MMP-9和IL-1蛋白表达水平评估炎症因子水平;TUNEL染色评估凋亡细胞数量;Iba1和MPO免疫荧光染色评估小胶质细胞活化
3、和中性粒细胞渗出情况。结果:mNSS评分结果显示ICH+SalB组神经功能缺损低于ICH+Vehicle组(P0.05);转角实验结果显示ICH+SalB组右转次数低于ICH+Vehicle 组(P0.05);HE 染色结果显示 ICH+SalB 组脑组织损伤、血肿面积较 ICH+Vehicle 组降低(P0.05);脑含水量结果显示ICH+SalB组脑水肿程度轻于ICH+Vehicle组(P0.05);EB外渗结果显示ICH+SalB组EB外渗低于ICH+Vehicle组(P0.05);Western blot结果显示ICH+SalB组MMP-9、IL-1表达低于ICH+Vehicle组(P
4、0.05),ICH+SalB组ZO-1、occludin表达高于ICH+Vehicle组(P0.05);TUNEL结果显示ICH+SalB组凋亡细胞数量低于ICH+Vehicle组(P0.05);免疫荧光检测显示ICH+SalB组Iba1和MPO水平均低于ICH+Vehicle组(P0.05)。结论:SalB可能通过减少小鼠ICH后的脑水肿、降低炎症因子、稳定血脑屏障的机制改善神经功能,发挥神经保护作用。关键词脑出血;丹酚酸B;炎症;神经保护;血脑屏障中图分类号 741;741.02;743 文献标识码ADOI10.16780/ki.sjssgncj.20230361本文引用格式:木艳玲,刘扬
5、,李媛,薛孟周.丹酚酸B对小鼠脑出血的神经保护作用研究J.神经损伤与功能重建,2023,18(8):435-440.Neuroprotective Effect of Salvianolic Acid B on Intracerebral Hemorrhage in MiceMU Yan-ling1,2,LIU Yang1,2,LI Yuan1,2,XUE Mengzhou1,2.1.Department of Cerebrovascular Diseases,The Second Affili-ated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 4
6、50001,China;2.Henan Medical Key Laboratory of Trans-lational Cerebrovascular Diseases,Zhengzhou 450001,ChinaAbstract Objective:This aim of this study was to investigate the neuroprotective effect of salvianolic acid B(SalB)on intracerebral hemorrhage(ICH)in mice,and to elucidate the underlying mecha
7、nism.Methods:A to-tal of 108 C57BL/6J male mice were randomly divided into the Sham,ICH+Vehicle,and ICH+SalB groups,with 36 mice per group.The ICH model was prepared with type collagenase.Mice in the ICH+SalB groupwere injected with 30 mg/kg SalB via the tail vein at 2 hours after operation,and mice
8、 in the Sham and ICH+Ve-hicle groups were similarly injected with the same amount of normal saline via the tail vein for 3 consecutivedays.On the 3rdday after operation,the modified neurological severity score(mNSS)and corner turn test wereconducted to assess behavioral indexes.Further,hematoxylin a
9、nd eosin(HE)staining was used to observe injuryto the brain tissues,brain water content was measured to evaluate cerebral edema,and Evens blue(EB)extrava-sation test was used to evaluate the permeability of the blood-brain barrier(BBB).In addition,western blot wasperformed to detect the expression l
10、evels of ZO-1 and Occludin to evaluate the integrity of the BBB and to de-tect the expression levels of MMP-9 and IL-1 as exemplar inflammatory factors.Finally,TUNEL staining wasperformed to evaluate the number of apoptotic cells,and immunofluorescence staining using Iba1 and MPO wasadopted to evalu
11、ate microglia activation and neutrophil exudation.Results:The results of mNSS testingshowed that the neurologic deficit degree in the ICH+SalB group was lower than that in the ICH+Vehicle group(P0.05),while in the corner turn test,the number of right turns in the ICH+SalB group was less than that in
12、ICH+Vehicle group(P0.05).HE staining showed that the degree of brain tissue injury and hematoma area inthe ICH+SalB group were reduced compared to the ICH+Vehicle group(P0.05).Brain water content analysisshowed that the degree of cerebral edema in the ICH+SalB group was less than that in the ICH+Veh
13、icle group(P0.05),and the EB extravasation level in the ICH+SalB group was lower than that in ICH+Vehicle group(P0.05).Further,the western blot results showed that the expression levels of MMP-9 and IL-1 in ICH+SalBgroup were lower than those in the ICH+Vehicle group(P0.05),while the expression leve
14、ls of ZO-1 and Occlu-din in ICH+SalB group were higher than those in the ICH+Vehicle group(P0.05).TUNEL staining showed435Neural InjuryAnd Functional Reconstruction,August 2023,Vol.18,No.8that the number of apoptotic cells in the ICH+SalB group was lower than that in ICH+Vehicle group(P0.05).Finally
15、,the immunofluores-cence staining results showed that the Iba1 and MPO levels were lower in the ICH+SalB group than in the ICH+Vehicle group(P0.05).Conclusion:Overall,our results indicate that SalB may improve neurological function and play a neuroprotective role by reducing cere-bral edema,the leve
16、l of inflammatory factors,and stabilizing the blood-brain barrier in mice with ICH.Keywordsintracerebral hemorrhage;Salvianolic acid B;inflammatory;neuroprotection;blood-brain barrier脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是致死率最高的卒中类型1,常遗留不同程度的肢体残疾和功能障碍。ICH造成的脑损伤分为原发性和继发性2。原发性脑损伤主要由血液聚集形成的血肿对周围组织的压迫,导致脑室内压
17、力增加,破坏脑组织结构,继而出现脑疝3;血肿释放炎症因子,对周围脑组织形成炎症损伤级联反应4,造成继发性脑损伤。神经炎症是导致继发性脑损伤及炎症性级联反应的主要原因,因此,抗炎治疗对脑损伤具有重要意义2,5。丹酚酸B(Salvianolicacid B,SalB)是丹参中水溶性活性最强的单体成分,具有抗炎抗氧化等生物学作用,SalB可以下调氧化应激分子的水平,对心、脑血管疾病6具有保护作用。在脊髓损伤中,SalB可促进少突胶质细胞的成熟和分化,减少脊髓损伤后轴突周围髓鞘的损伤,抑制细胞凋亡,促进运动功能恢复7。在创伤性脑损伤中,SalB通过降低脑血肿和炎症因子的表达改善神经功能缺损8。本研究通
18、过构建胶原酶小鼠ICH模型,研究SalB在脑水肿、抗炎、血脑屏障保护几个方面对神经功能的影响及其机制。1 材料与方法1.1 主要试剂与材料1.1.1实验动物810 周雄性 C57BL/6J 小鼠 118只,体质量2025 g,购于北京维通利华 生产许可证号:SCXK(京)2021-0006。排除死亡4只及Longa评分为0分6只,最终纳入108只的数据。本实验研究通过郑州大学伦理委员会批准【2023041】。1.1.2主要材料、试剂与仪器型胶原酶(Sigma,C0773);SalB(江苏永健医药科技有限公司,HB0160);兔抗白介素1多克隆抗体(Abcam,ab283818);兔抗小鼠ZO-
19、1抗体(Abcam,ab307799);兔抗小鼠Occludin抗 体(Abcam,ab216327);兔 抗 小 鼠 MMP-9 抗 体(Abcam,ab134455);兔抗小鼠GAPDH抗体(Abcam,ab9484);TUNEL试剂盒(Sigma,APT110);兔抗髓过氧 化 物 酶(myeloperoxidase,MPO)多 克 隆 抗 体(Abcam,ab208670);兔抗小胶质标记物(IBA1)抗体(Wako,019-19741);伊 文 思 蓝(Evans blue,EB)(sigma,206-252-5)。小鼠脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司,ZH-蓝星C/S型)
20、;正置光学显微镜(Zeiss,BX53);激光共聚焦显微镜(OLYMPUS,FV1000)。1.2 方法1.2.1实验分组入组的108只小鼠随机分为Sham组、ICH+Vehicle组、ICH+SalB组,每组36只。1.2.2ICH模型制备与用药10%水合氯醛麻醉小鼠(4 mL/kg),俯卧位放置于脑立体定位仪,去毛,以前囟为原点,向前0.2 mm,中线右旁开2.0 mm,用颅骨钻钻取直径0.6 mm小孔,ICH+Vehicle组和ICH+SalB组用微量进样器从小孔表面垂直下降3.5 mm,以0.1 L/min给予型胶原酶 0.75 L(0.1 U/L)至纹状体诱导ICH,结束后留针5 m
21、in,防止胶原酶回流,以1 mm/min速度缓慢退针;Sham组纹状体内予等量生理盐水。术后将小鼠放置在37 恒温板上复温,ICH+SalB组在术后2 h尾静脉注射SalB 30 mg/kg(4 mg SalB/mL生理盐水),连续3 d;Sham组和ICH+Vehicle组尾静脉注射等量生理盐水。1.2.3小鼠神经功能观察术后第3天,每组选择12只小鼠进行mNSS评分,评估运动、感觉、平衡木实验、反射丧失和不正常运动。mNSS评分为018分(16 分轻度损伤,712 分中度损伤,1318 分重度损伤)。转角实验:每组12只小鼠进行转角实验评估神经行为学。将小鼠放置在由2块硬纸板构成的30夹角
22、里,观察小鼠不受干扰的向左或向右转向的次数,每只小鼠重复10次,2次测试间隔30 s,右转百分比(%)=右转次数/所有转向次数100%。1.2.4脑组织标本制备造模后第3天,水合氯醛腹腔麻醉小鼠,先后给予200 mL生理盐水和200 mL多聚甲醛心脏灌注后,断头取脑浸泡于甲醛,石蜡包埋固定切片,用于HE、TUNEL、Iba1和MPO染色。1.2.5HE染色造模后3 d进行,用于评估脑组织损伤,将切片置于50 恒温箱中干燥30 min后HE染色,使用显微镜在40倍数下观察脑损伤面积。1.2.6脑含水量评估造模后1 d、3 d,麻醉小鼠后快速断头取脑,分为左右大脑半球和脑干,分别称取湿436神经损
23、伤与功能重建2023年8月第18卷第8期重,后放入100 烘箱烘烤24 h,称取干重。脑含水量(%)=(湿重干重)/湿重100%。1.2.7EB外渗实验用于评估血脑屏障完整性。脑出血3 d后,尾静脉注射2%EB溶液(4 mL/kg),体内循环 46 h。小鼠麻醉完全后固定,剪开胸部,先后用200 mL生理盐水和200 mL多聚甲醛灌注。快速取大脑半球,并分为左右大脑半球。分别称重后与去离子化甲酰胺以120(1 g脑湿重20 mL去离子甲酰胺)混成匀浆,置于60 水浴中24 h。以20000 rpm离心30 min取上清液,分光光度计法测630 nm吸光值。计算脑组织EB含量(g/g)=EB浓度
24、(mg/L)甲酰胺体积(mL)/脑组织湿重(g)。结果以同侧/对侧脑EB含量之比表示。1.2.8Western blot蛋白定量分析ICH后3 d,取血肿周围1 mm脑组织,称重,RIPA裂解液裂解,研磨、离心、取上清液后BCA蛋白定量,分光光度计测562 nm的OD值,计算蛋白浓度,将蛋白体积与上样缓冲液按14配置并煮沸备用。孵育一抗,兔抗MMP-9抗体、兔抗IL-1抗体、兔抗ZO-1抗体、兔抗occludin抗体(均为11000)。清洗后孵育二抗,兔 IgG 抗体室温下 1 h。Image J分析光密度。1.2.9TUNEL染色造模后3 d,石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后,PBS洗涤。
25、蛋白酶K通透,PBS再洗涤后,使用TdT标记反应缓冲液37 孵育60 min,洗涤后封片。在200倍荧光显微镜下,计数4个视野里的凋亡细胞数。1.2.10免疫荧光染色造模后3 d,采用Iba1和MPO染色评估血肿周围炎性细胞活化和渗出情况。将石蜡切片标本用二甲苯和梯度乙醇处理脱蜡至水,柠檬酸钠抗原修复,PBS冲洗,室温封闭,兔抗Iba1多克隆抗体(1200)和兔抗髓过氧化物酶(MPO)单克隆抗体(1200)分别孵育过夜,清洗后选择二抗山羊抗兔IgG HL(Alexa Fluor488)孵育。在200倍荧光显微镜下,计数4个视野里的小胶质细胞和中性粒细胞。1.3 统计学处理使用SPSS 26.0
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